两种微量RNA扩增方法的比较研究

本研究通过比较体外转录和单引物扩增这两种扩增微量RNA的不同方法,以寻找一种高效的扩增方法。我们用两种不同方法分别扩增小鼠大脑全皮层及第五皮层细胞的RNA,扩增的RNA合成cDNA后进行荧光定量PCR实验,根据PCR结果比较两种不同扩增方法的效率。WT-ovation扩增RNA的效率约为IVT效率的2.8倍;IVT方法扩增后,基因D-C值与引物距离mRNA 3'端的长度及mRNA的长度均存在正线性相关(P<0.05),即引物距离mRNA的3'端越近、mRNA越短,基因D-Ct值越低。而WT-ovation方法扩增后,基因D-Ct值与引物距离mRNA 3'端的长度及mRNA的长度均不存在统计学相关性。与IVT方法相比,WT-ovation方法效率更高,扩增时受影响因素较少、更稳定。     

p85a基因对人神经母细胞瘤SY5Y细胞迁移的影响

通过干扰p85a基因的表达,探讨其在人神经母细胞瘤SY5Y细胞迁移中的作用及对m RNA和蛋白质水平的影响。首先,构建p85a基因的干扰质粒si RNA质粒(si-p85a)和过表达质粒(OE-p85a),转染人神经母细胞瘤SY5Y细胞,48 h后,用定量PCR方法检测p85a基因的m RNA水平变化;Western blot检测其蛋白质水平变化;用流式细胞术检测细胞周期变化;随后,将si-p85a、OE-p85a等质粒转染12孔板中的细胞,分别在24、48、72 h时做划痕实验,观察细胞迁移的变化。定量PCR显示,与MOCK组相比,不同组p85a基因表达有差异。干扰质粒(si-p85a)组表达降低,约为对照组的0.42倍;而过表达(OE-p85a)组表达明显升高,为对照组的22.84倍,均有显著性统计学差异(P0.05)。Western blot结果显示,转染si-p85a质粒后,p85a蛋白质水平下降;而转染OE-p85a质粒,p85a蛋白质水平升高。划痕实验中,转染OE-p85a可促进SY5Y细胞迁移,转染si-p85a后抑制细胞迁移,均有统计学差异(P0.05)。实验结果表明,在SY5Y细胞生长过程中,p85a基因起到重要作用,可以促进SY5Y细胞迁移运动。     

小鼠大脑皮质脊髓投射神经元核糖体蛋白质相关基因表达的研究

该研究采用激光显微切割技术从小鼠大脑第五皮层捕获少量皮质脊髓投射神经元,并分析其分子生物学特征。首先,提取神经元微量RNA,再借助WT-ovation试剂盒扩增RNA,随后利用合成的cDNA进行荧光定量PCR实验,分析投射神经元核糖体蛋白相关基因的表达情况。结果发现,与大脑皮层其它皮层组织相比,第五皮层投射神经元内部分核糖体蛋白相关基因的表达相对较高。这表明第五皮层投射神经元可能具有活跃的蛋白质合成功能,是核糖体蛋白质的能量场所,借此维持第五皮层脊髓投射神经元长轴突和大胞体的能量需要。     

MicroRNA-34a抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的研究

该文采用阳离子脂质体Lipofectamine介导的方法将microRNA-34a转染入体外培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5。应用BrdU法、细胞平板克隆形成实验检测转染microRNA-34a后对细胞增殖的影响,发现M23和SP6.5细胞增殖明显被抑制(P<0.01);并利用流式细胞技术检测转染microRNA-34a后细胞周期的变化,发现细胞停滞于G_1期;同时检测转染microRNA-34a后细胞caspase-3/7酶的活性,发现无明显改变。另外,Real-time PCR检测表明阿霉素处理后M23、SP6.5细胞中microRNA-34a的表达量上调(P<0.01)。用阿霉素处理转染microRNA-34a的M23、SP6.5细胞,检测caspase-3/7酶活性的改变,发现caspase-3/7酶活性显著增加(P<0.01)。本研究表明microRNA-34a通过抑制细胞周期来抑制体外培养的人葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖,能够增加细胞对阿霉素的敏感性,但不直接诱导细胞凋亡。     

p85a基因对小鼠大脑皮层投射神经元迁移的影响

Pi3k/Akt信号通路是近年来发现的参与细胞增殖、调控的重要通路,Pi3k激活可介导多种细胞功能,Pi3k由p85a和p110构成。该研究通过干扰p85a基因的表达,探讨其在小鼠大脑皮层投射神经元迁移中的作用。首先,构建p85a基因的对照质粒（scramble）、siRNA质粒（sip85a-1、sip85a-2）和过表达质粒（OEp85a）;接着转染N2a细胞,48 h后,用定量PCR方法检测p85a基因mRNA的表达情况。随后,将sip85a-1、sip85a-2、OEp85a质粒分别转入小鼠大脑,4 d后,借助免疫荧光方法检测皮层神经元的迁移情况。定量PCR结果显示：与对照相比,转染sip85a-1、sip85a-2均能显著降低N2a细胞中p85a基因的mRNA表达,抑制效率约为40%（P〈0.05）;而转染OEp85a质粒后,能显著增加p85a基因mRNA的表达,约为对照组的12倍（P〈0.01）。胚胎电转结果中,各区EGFP阳性神经元数目定量分析显示,sip85a-1、sip85a-2、OEp85a质粒均能显著抑制神经元的迁移（P〈0.05）。大脑发育阶段中,p85a基因在适当范围内,对平衡神经元迁移过程中起着重要作用。