肺炎克雷伯菌耐氨基糖苷类抗生素基因aac（3）-I的改构与功能

研究氨基糖苷乙酰转移酶基因aac(3)-I碱基变异与功能的关系。构建表达载体pET28a-aac(3)-I,转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),筛选到阳性克隆送测序。然后在体外对aac(3)-I基因进行易错PCR改造,筛选到一株阳性克隆测序后发现7处碱基变异,其中C272T、T373C引发了氨基酸的变异,分别对应:Ser91Phe、Tyr125His。以琼脂稀释法检测不同克隆的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。实验结果表明变异株MIC较突变前下降64倍(庆大霉素)、4倍(阿米卡星)、8倍(依替米星)。为进一步了解和阐明耐药酶AAC(3)-I与底物的作用机制打下基础。     

氨基糖苷-(3)-乙酰转移酶II的表达纯化及初步活性

用PCR扩增的氨基糖苷-(3)-乙酰转移酶II[aac(3)-II]基因构建了能表达较高活性AAC(3)-II的重组工程菌,并获取重组AAC(3)-II。含pET28a质粒的工程菌转入aac(3)-II基因前后对氨基糖苷类抗生素的最低抑菌浓度进行比较,重组菌超声裂解上清液及其纯化的AAC(3)-II进行SDS-PAGE和Western印迹电泳鉴定。最低抑菌浓度表明转入aac(3)-II基因的工程菌比未转入的工程菌对庆大霉素(gentamicin,GEN)的提高了256倍,对妥布霉素(tobramycin,TOB)及其奈替米星(netilmicin,NTL)提高了16倍,电泳鉴定表明纯化获取的是重组AAC(3)-II,其相对分子质量约为32kDa,纯度大于95%,纯化后的10μgAAC(3)-II,分别在10s内使80μgGEN、30s内使80μgTOB和NTL乙酰化而失去抑菌作用。研究为氨基糖苷类抗生素伴侣的开发研究初步打下基础。     

氨基糖苷-(3)-乙酰转移酶Ⅱ的表达纯化及初步活性

用PCR扩增的氨基糖苷-（3）-乙酰转移酶Ⅱ[aac（3）-Ⅱ]基因构建了能表达较高活性AAC（3）-Ⅱ的重组工程菌,并获取重组AAC（3）-Ⅱ。含pET28a质粒的工程菌转入aac（3）-Ⅱ基因前后对氨基糖苷类抗生素的最低抑菌浓度进行比较,重组菌超声裂解上清液及其纯化的AAC（3）-Ⅱ进行SDS-PAGE和Western印迹电泳鉴定。最低抑菌浓度表明转入aac（3）-Ⅱ基因的工程菌比未转入的工程菌对庆大霉素（gentamicin,GEN）的提高了256倍,对妥布霉素（tobramycin,TOB）及其奈替米星（netilmicin,NTL）提高了16倍,电泳鉴定表明纯化荻取的是重组AAC（3）-Ⅱ,其相对分子质量约为32kDa,纯度大于95％,纯化后的10μg AAC（3）-Ⅱ,分别在10s内使80μg GEN、30s内使80μg TOB和NTL乙酰化而失去抑菌作用。研究为氨基糖苷类抗生素伴侣的开发研究初步打下基础。