Thr28突变对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ钠通道活性的影响

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成法合成了用谷氨酸(Glu)替代HWTX-Ⅳ第28位苏氨酸残基的突变体T28D-HWTX-Ⅳ,线性多肽合成产物经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术鉴定分子质量,通过全细胞膜片钳电生理技术测定其电压门控钠通道药理学活性.当第28位Thr残基被Glu取代后,突变体T28D-HWTX-Ⅳ对表达于大鼠DRG细胞膜上的TTX-S钠通道的IC50值约为362 nmol/L,对TTX-S钠通道的抑制活性比天然HWTX-Ⅳ(IC50值=30 nmol/L)下降了约12倍,显示第28位的Thr残基是HWTX-Ⅳ与TTX-S型钠通道相互作用的关键活性残基.目前的研究为进一步探索HWTX-Ⅳ的结构与功能关系及新型镇痛药物的研发奠定了基础.     

新疆额尔齐斯河流域冷水鱼肠道耐低温乳酸菌的分离筛选及其遗传差异

[目的]从新疆阿勒泰地区额尔齐斯河流域冷水鱼肠道中分离耐低温的乳酸菌,挖掘乳酸菌的物种和遗传多样性,为低温乳酸菌生物技术研发提供优良菌种.[方法]利用MRS、Elliker两种不同培养基从9种冷水鱼肠道中,分离筛选出耐低温菌,测定细菌最适生长温度并进行常规生理生化实验.根据16S rRNA基因序列初步确定耐低温菌的系统进化地位,并采用BOX、(GTG)5、ERIC三种不同的引物进行rep-PCR,对16S rRNA基因高度同源性的菌株进一步区分.[结果]分离得到78株耐冷菌,最终确定有24株为耐低温乳酸菌,菌株的最适生长温度在15-24℃之间.系统发育分析结果表明:24株耐低温乳酸菌隶属于6个属,其中肉杆菌属(Carnobacterium)3株,乳球菌属(Lactococcus)9株,肠球菌属(Enterococcus)7株,环丝菌属(Brochothrix)1株,魏斯氏菌属(Weissella)2株,链球菌属(Streptococcus)2株.指纹图谱聚类分析树状图显示乳球菌属(Lactococcus)和肠球菌属(Enterococcus)存在种及菌株水平上的遗传差异,前者包括4个种,后者2个种.[结论]新疆额尔齐斯河流域冷水鱼肠道中分离的耐低温乳酸菌以球菌为主,没分离到常见的乳杆菌,需进一步完善分离培养的方法,深入挖掘和研究其物种多样性和遗传多样性.     

虎纹蜘蛛毒素-Ⅰ对大鼠急性内脏疼痛的抑制性效应及与ω-芋螺毒素的比较研究(英文)

研究一种新型的N型电压敏感性钙通道阻断剂虎纹蜘蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ ) ,硬脊膜外腔用药对福尔马林结肠壁粘膜下注射诱导的大鼠急性炎性内脏疼痛的抑制性效应 .5 %福尔马林溶液15 0 μl快速注入SD大鼠乙状结肠壁粘膜下层 ,可产生几种可评估的反映内脏疼痛的固定性行为 .在此伤害性刺激反应前 30min ,经留置的导管向大鼠硬脊膜外腔分别注入各待测药品和试剂 ,观察其对该模型疼痛行为的影响 .与生理盐水阴性对照组 ,美国同类镇痛新药ω 芋螺毒素 (ω CTX MVIIA)和吗啡两个阳性对照组比较 ,HWTX Ⅰ五个剂量组 ,进行大鼠硬脊膜外腔注药 ,均能以剂量依赖方式明显抑制福尔马林结肠壁注射诱导的伤害性行为反应 .HWTX Ⅰ和ω CTX MVIIA在 2 0μg kg体重剂量时 ,其抑制效果是稳定和明显的 ;在 5 0 70 μg kg体重剂量下 ,抑制效果更为显著 .HWTX Ⅰ量 效实验发现 ,在等剂量下 ,ω CTX MVIIA镇痛效果略高于HWTX Ⅰ .但在 5 0～ 75 μg kg较高剂量下 ,ω CTX MVIIA可能引起大鼠产生明显的运动能力障碍 ,而HWTX Ⅰ在该剂量范围内则未见类似的毒副作用 .盐酸吗啡镇痛作用起效快于HWTX Ⅰ和ω CTX MVIIA ,但维持时间较后二者短 .实验结果表明 :同为多肽类N型电压敏感性钙通道拮抗剂 ,HWTX Ⅰ和ω CTX MVIIA大鼠硬脊     

小麦分蘖角度TaTAC1基因同源克隆及表达分析

分蘖角度影响植物群体结构、光合效率以及植株的形态建成,最终影响其产量及品质。小麦中关于分蘖角度的研究鲜有报道。前人研究显示,水稻OsTAC1正向调控分蘖角度的大小,玉米Zm TAC1与叶片角度呈正相关。本研究的目的是解析Ta TAC1的表达模式并初步了解该基因的分子遗传机制及其与分蘖角度的遗传关系。本研究以CN16、SM969、Lan2399、SHW-1为材料,利用同源克隆分离获得Ta TAC1,利用生物信息学软件对Ta TAC1进行序列特征分析,应用实时荧光定量PCR对其表达模式进行分析,并进行Ta TAC1蛋白的亚细胞定位分析。结果显示,Ta TAC1长度约1.1~1.2 kb,包括780 bp的完整开放阅读框和320~370 bp的3'-UTR。Ta TAC1的c DNA序列分为2类,其中CN16-2、SM969-2的第10号碱基发生突变,引起终止子提前,导致Ta TAC1表达受阻;Lan2399-2和SHW-1-2在109~115碱基位置有"CGCGCG"片段插入,导致蛋白质β-折叠片减少。表达分析表明,Ta TAC1在分蘖期的叶鞘、茎高效表达,分蘖节其次,叶与根表达量最低。相关分析表明该基因在分蘖节各时期表达量与分蘖角度呈显著正相关,Pearson相关系数为0.677,其他组织表达量与分蘖角度无显著相关性。亚细胞定位分析显示Ta TAC1定位于细胞膜。从上述结果可以推测Ta TAC1在mRNA水平上正向调控分蘖角度,且可能参与生长素极性运输过程从而改变分蘖角度大小。     

敬钊毒素-XI与突变体R3A-JZTX-XI的合成、复性及其药理活性鉴定

表达于b-胰岛细胞上的Kv2.1钾通道电流负责动作电位的复极化,从而调节胰岛素的分泌,是治疗2型糖尿病的有效作用靶点。敬钊毒素-XI(JZTX-XI) 是从敬钊缨毛蛛Chilobrachys jingzhao粗毒中分离纯化到的一种新型的肽类神经毒素,能够抑制非洲爪蟾卵母细胞上表达的Kv2.1钾通道电流。为了研究JZTX-XI的结构与功能关系,用芴甲氧羰基 (Fomc) 固相多肽合成方法合成了野生型JZTX-XI和突变体R3A-JZTX-XI,结合反相HPLC和质谱对不同条件下的氧化复性结果进行检测,从而得     

虎纹捕鸟蛛神经细胞急性分离培养及其电压门控通道膜片钳

探索了虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)食道下神经细胞急性分离培养条件,并利用全细胞膜片钳技术对虎纹捕鸟蛛食道下神经细胞电压门控性钠、钾和钙通道的基本电生理学特性进行了研究.适合虎纹捕鸟蛛神经细胞离体培养的培养基为(g/L):葡萄糖0.7,果糖0.4,琥珀酸0.06,咪唑0.06,L-1513.7,Hepes 2.38,酵母粉2.8,乳白蛋白2.5,青霉素200 IU/ml,链霉素200 mg/ml,小牛血清15%;pH 6.8.该培养基非常适合虎纹捕鸟蛛神经节神经细胞离体培养,细胞在温度(27±2)℃的培养箱中培养2～4h,培养的细胞数目多、结构完整、贴壁效果好,细胞近似汤勺形,有一个长的单极突起,大部分细胞在10～30μm之间.全细胞模式下可以记录到钠、钾和钙三种电压门控离子通道电流.钙电流为高电压激活电流,该电流能够被NiCl2完全抑制;钾电流为瞬时钾电流和延迟整流钾电流,这两类钾电流分别被细胞外液中的4-氨基吡啶和氯化四乙胺所阻断;钠电流为TTX敏感型电流.     

复方苦参注射液腔内灌注治疗对恶性胸腔积液患者机体免疫功能及肿瘤标志物水平的影响

摘要 目的：探讨复方苦参注射液腔内灌注治疗对恶性胸腔积液患者机体免疫功能及肿瘤标志物水平的影响。方法：选取河北北方学院附属第一医院2020年12月到2022年12月期间收治的52例恶性胸腔积液患者,将每位患者随机进行编号,获得1～52个编号,按照奇偶法将患者分为对照组（n=26）和观察组（n=26）。对照组采用顺铂腔内灌注治疗,观察组在对照组的基础上联用复方苦参注射液腔内灌注治疗,比较两组患者的治疗效果、T淋巴细胞亚群（CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原125（CA125）、生活质量改善率以及毒副反应。结果：观察组治疗总有效率73.08%高于对照组的42.31%（P＜0.05）。治疗后观察组的CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺与治疗前比较明显升高,且高于对照组（P<0.05）。治疗后两组患者的血清CEA、CA125水平与治疗前比较均明显降低,且观察组低于对照组（P<0.05）。观察组生活质量改善率76.92%高于对照组46.15%（P<0.05）。观察组的骨髓抑制、胃肠道反应明显轻于对照组（P<0.05）。结论：复方苦参注射液腔内灌注治疗对恶性胸腔积液患者具有较好的疗效,且可以改善患者机体免疫功能及生活质量,降低血清肿瘤标志物水平和毒副反应。     

敬钊毒素-Ⅴ的合成、复性及其钾通道活性鉴定

敬钊毒素-Ⅴ(jingzhaotoxin-Ⅴ,JZTX-Ⅴ)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化得到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂.为了深入研究该毒素的功能,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了JZTX-Ⅴ,合成多肽经谷胱甘肽法氧化复性后,利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化.复性产物的相对分子质量经质谱测定为3 605.51,而与天然毒素混合进行HPLC共洗脱实验时也只得到单一峰.全细胞膜片钳实验显示,JZTX-Ⅴ能够抑制大鼠背根神经节细胞上的A型钾电流,却对外向延迟整流钾电流没有影响,对处于静息关闭状态的A-型钾通道也表现出较高的亲和性.JZTX-Ⅴ对A型钾通道的这种抑制作用具有浓度依从性, 其半数有效抑制浓度(IC50)为52.3 nmol/L. JZTX-Ⅴ通过引起A型钾通道的活化曲线往去极化方向漂移,和失活曲线往超极化方向漂移来改变通道的门控特征.目前的研究结果为深入开展JZTX-Ⅴ的功能研究及分子改造奠定了基础.     

Lys4突变对敬钊缨毛蛛毒素-V钠通道活性的影响

敬钊缨毛蛛毒素-V(jingzhauotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂,为了深入研究该毒素的结构与功能关系,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第4位赖氨酸残基的突变体K4A-JZTX-V,合成线性多肽经反相高效液相色谱分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物分别用MALDI-TOF/TOF质谱进行相时分子质量的鉴定,用膜片钳电生理方法进行电压门控钠通道抑制活性分析.研究结果表明,Lys4被Ala取代后,K4A-JZTX-V对大鼠背根神经节细胞膜上表达的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的抑制活性与天然JZTX-V基本相当,提示Lys4与JZTX-V时TTX-S钠通道的抑制活性关系不大;而K4A-JZTX-V对河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道的抑制活性却比天然JZTX-V下降了约8.3倍,说明Lye4是JZTX-V与河豚毒素不敏感型钠通道抑制活性相关的氨基酸残基.     

Arg20突变对敬钊缨毛蛛毒素-V钠通道活性的影响

敬钊缨毛蛛毒素-V(Jingzhaotoxin-V, JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂, 为了深入研究该毒素的结构与功能关系, 应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第20位精氨酸残基的突变体R20A-JZTX-V, 合成线性多肽经反相高效液相色谱分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性。复性产物分别用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)进行分子量的鉴定, 用膜片钳电生理方法进行电压门控钠通道抑制活性分析。研究结果表明, Arg20被Ala取代后, R20A-JZTX-V对大鼠背根神经节细胞(DRG)膜上表达的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的抑制活性与天然JZTX-V相当, 提示Arg20与JZTX-V对TTX-S钠通道的抑制活性无关或关系不大; 而R20A-JZTX-V对TTX-R钠通道的抑制活性却比天然JZTX-V下降了约18.3倍, 说明Arg20是与JZTX-V对河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道抑制活性相关的关键活性残基之一, 推测R20A-JZTX-V活性降低的原因是用Ala替代Arg20后改变了JZTX-V与TTX-R型钠通道的作用位点。