多聚ADP-核糖聚合酶抑制剂对高浓度锌损伤 PC12细胞的保护作用

探讨多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)对400μmo1/L氯化锌损伤PC12细胞的保护作用及其对锌造成的细胞死亡类型的影响.应用MTT法,免疫细胞化学和Western印迹分别测定PC12细胞的存活率和PARP活性;用Hoechst 33342/PI荧光双染色、膜联蛋白V结合实验及DNA断裂分析等方法检测细胞死亡类型.结果表明在400μmol/L氯化锌的作用下,细胞存活率降至(22.7±4.6)%,PARP活性增强,坏死、凋亡和正常细胞百分比分别为(58.4±6.3)%、(18.0±5.6)%及(23.6±4.2)%;3-AB使细胞存活率提高至(76.9±4.7)%,PARP活性减弱,坏死细胞百分数降至(19.2±5.2)%,而正常和凋亡细胞百分数增加到(43.3±1.9)%和(37.5±6.5)%.实验证明,PARP参与了高浓度锌诱导的PC12细胞损伤,抑制PARP活性可提高细胞的存活率,而这种保护作用在于减少细胞的坏死而非凋亡.     

bHLH因子对大脑神经前体细胞的增殖分化与命运决定的调节北大核心CSCD

神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,它的增殖和分化受到多种内源或者外源因子,以及邻近或远程细胞信号通路的调控。多项研究表明,碱性螺旋——环——螺旋(basic helix-loop-helix,b HLH)家族转录因子之间相互联系,相互竞争,广泛参与调控端脑的发育过程,在NPCs向神经元和神经胶质细胞分化过程中起着重要的调控作用。而b HLH家族分子的不同的表达状态,即持续表达或波动表达,又与NPCs增殖或者分化的最终结局有着重要的关系。本文主要对在端脑发育中有重要代表性作用的b HLH转录因子,以及它们之间的表达调控关系的研究进展进行综述。     

5-羟甲基胞嘧啶及其TET氧合酶在神经系统发育和相关疾病中的研究进展

神经系统的正常发育是多种因素相互协调作用的结果,一旦特定因素失衡将引起相关疾病的发生。近年来不断有研究发现,DNA去甲基化过程的一类中间产物5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)作为一种新的表观遗传标记,在神经系统中高水平分布,并参与认知、记忆等重要的神经功能。5hmC的形成由氧合酶家族分子(ten-eleven translocation protein, TET)催化,在多种神经系统相关疾病中,5hmC水平和TETs分子的表达都发生改变,提示TET-5hmC表观遗传机制在复杂的神经系统发生发展过程中发挥了重要的调控作用。此外,作为基因表达调控的DNA标记物,5hmC的基因定位与基因表达水平的关系也是重要的研究方向。本文就近年来5hmC和TET家族蛋白分子在神经系统发育和相关疾病方面的重要研究发现进行了综述总结,希望为相关领域研究人员深入开展研究提供重要的思路,并为相关疾病设计治疗策略提供理论支持。     

成年转基因小鼠嗅鞘细胞的培养、纯化及生物学特性

已有多项研究表明,嗅鞘细胞具有修复中枢及外周神经损伤的潜能。我们选用了表达增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,eGFP)的成年小鼠,分离其双侧嗅球嗅神经纤维层及嗅小球层细胞,体外原代培养并予以纯化。同时结合共聚焦、相差显微镜,细胞增殖分析及免疫组织化学鉴定等技术,对其生物学活性进行研究。结果表明:(1)原代培养转基因成年小鼠嗅球嗅鞘细胞(Olfactoryensheathingcells,OECs)15d后,主要存在两种不同形态和免疫组织化学特征的细胞。一种是带有长突起的双极或多极OECs,表达P75~(NIR)(P75lowaffinityneurotrophicreceptor)S100和胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)。另一种则是对Thy1.1抗体免疫反应阳性,呈扁平或内皮样形态的成纤维细胞。(2)根据不同类型细胞在未覆层的培养器皿上贴壁速度的差异,我们建立了一种简单易行、不需任何抗体或昂贵仪器的细胞纯化方法,获得了大量高纯度的OECs。(3)在连续纯化培养22d后,OECs仍能保持较高的增殖活性。本实验支持和丰富了OECs发育的相关理论,为进一步体内移植修复CNS损伤提供了理想的材料。     

新生鼠中枢神经系统内Nestin蛋白免疫阳性的组织分布

为了观察Nestin在新生SD大鼠中枢神经系统中的分布,探讨神经干细胞在新生鼠的分布.采用免疫荧光法,显示含神经干细胞特征性的标志物Nestin的阳性结构在新生SD大鼠中枢神经系统中的分布.结果表明在新生SD大鼠中枢神经系统中,Nestin在前脑、脑干和小脑的各个部位均有表达,阳性结构多为纤细的纤维状突起,分布密集,标记强度多为中等强度,分布相对比较均匀.在脊髓实质的Nestin免疫阳性产物明显减少,分布稀疏,染色也较浅,中央管Nestin免疫染色阳性的室管膜细胞很少,但在脊髓中央管的背侧(延髓见于腹侧和背侧)可见到“喷泉”状免疫强阳性纤维束垂直伸展,直达软膜.由此可得出结论:新生SD大鼠中枢神经系统的广泛脑区均存在大量的神经干细胞,而脊髓的神经干细胞数目较少,提示神经干细胞在生后从神经系统的尾端开始逐渐减少.     

表观遗传学新标记——5-羟甲基胞嘧啶检测方法的研究进展

被称为"第六种碱基"的5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC),广泛分布于多种哺乳动物的组织和细胞中,与胚胎发育,神经系统功能以及肿瘤研究高度相关.与5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)相比,5hmC在组织中含量更低,难以精确的检测.随着研究的深入,5hmC参与的重要生物学作用逐渐被人们发现,同时也促使着5hmC的检测和定量方法不断发展.为了区分5hmC与其他胞嘧啶衍生物,很多利用化学或者酶学修饰实现靶向检测或非靶向富集5hmC的方法应运而生.因此,选择并发展灵敏,准确,可靠的5hmC检测技术对于表观遗传研究至关重要.本文重点综述了近年来发展起来的5hmC检测和测序技术,通过比较分析各种方法的优缺点,为研究人员选择特定合适的方法开展相关研究提供重要的参考.     

成年转基因小鼠嗅鞘细胞的培养、纯化及生物学特性

已有多项研究表明,嗅鞘细胞具有修复中枢及外周神经损伤的潜能。我们选用了表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）的成年小鼠,分离其双侧嗅球嗅神经纤维层及嗅小球层细胞,体外原代培养并予以纯化。同时结合共聚焦、相差显微镜,细胞增殖分析及免疫组织化学鉴定等技术,对其生物学活性进行研究。结果表明：（1）原代培养转基因成年小鼠嗅球嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）15d后,主要存在两种不同形态和免疫组织化学特征的细胞。一种是带有长突起的双极或多极OECs,表达P75^NTR（P75 low affinity neurotrophic receptor）、S100和胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）。另一种则是对Thy 1．1抗体免疫反应阳性,呈扁平或内皮样形态的成纤维细胞。（2）根据不同类型细胞在未覆层的培养器皿上贴壁速度的差异,我们建立了一种简单易行、不需任何抗体或昂贵仪器的细胞纯化方法,获得了大量高纯度的OECs。（3）在连续纯化培养22d后,OECs仍能保持较高的增殖活性。本实验支持和丰富了OECs发育的相关理论,为进一步体内移植修复CNS损伤提供了理想的材料。     

LINGO-1-Fc蛋白对低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

髓鞘抑制因子Nogo-A、MAG和OMgp通过共同的受体信号复合物NgR/p75NTR(或者TROY)发挥对中枢神经纤维再生的抑制作用.新近克隆的跨膜蛋白LINGO-1是该信号途径的另一个重要组成成分和调节分子.LINGO-1特异表达于中枢神经系统,神经元上的LINGO-1被证明参与调节中枢神经再生的抑制信号,而少突胶质细胞表达的LINGO-1分子参与负调节少突胶质细胞的髓鞘化过程.为探讨LINGO-1分子在神经元凋亡过程中的作用,利用包含LINGO-1分子胞外段LRR和IgC2结构域的Fc融合蛋白作为功能性拮抗剂,研究LINGO-1对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用.利用成熟的Hoechst标记凋亡细胞的方法,观察到经LINGO-1-Fc蛋白预处理2h能够显著阻止小脑颗粒神经元的凋亡.仅包括LRR结构域的GST-LINGO-1与LINGO-1-Fc蛋白,虽同样具有与颗粒神经元的结合活性,但是GST-LINGO-1不能有效地阻止低钾诱导的细胞凋亡.这些结果提示,LINGO-1-Fc蛋白能够阻止低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡,并且这种作用可能是IgC2结构域依赖的.     

逆转录病毒介导的人NT-3在嗅神经鞘细胞中的表达及活性检测

本文构建了pRev-TRF-NT-3的逆转录病毒表达载体,通过Fcopack293细胞将其与pRev-Tet-On分别进行包装,制备了重组缺陷型的hNT-3和Tet-on逆转录病毒,用这两种病毒感染原代培养大鼠嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),并经强力霉素(Dox)诱导,获得Dox浓度依赖性hNT-3表达的OECs,最后经过Western-Blot检测hNT-3的表达以及通过DRG与NT-3转染后OECs联合培养来对表达的hNT-3活性进行鉴定,结果:(1)hNT-3-pcDNA的多克隆位点,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,PCR扩增,再用Sall和Hind Ⅲ切下全长编码的hNT-3 cDNA,定向连接到pRev-TRF上,pRev-TRF全长为6.5kb,NT-3全长为0.78kb,pRev-TRE-NT-3重组体经过鉴定,确认插入子的方向和完整性,结果与预期相符。(2)hNT-3修饰的OECs培养上清经Western-blot检测,与hNT-3抗体结合的蛋白条带分子量约为28kd,hNT-3修饰过的OECs上清表达量明显高于未转染组OECs的表达量,且hNT-3表达量与Dox浓度有依赖性。(3)与hNT-3修饰的OECs联合培养背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),有许多DRG细胞向外迁移,这些细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。而未修饰的OECs组,只有少量的细胞迁移生长,细胞迁移和突起生长都很局限,空白对照组的DRG没有向外迁移的细胞和向外延伸的突起;且对照组的突起生长长度明显比NT-3修饰的实验组短(P<0.01)。这些结果表明,Tet-On调控NT-3表达在OECs转染成功,为进一步体内移植修复损伤提供了理想的材料。