家兔BMP7基因的克隆及其生物信息学分析

在对已知部分编码序列(CDS)进行分析的基础上, 采用RT-PCR分步扩增以及RACE方法, 对家兔BMP7基因3′和5′末端未知序列进行了克隆与生物信息学分析。测序结果综合分析表明, 所获序列共计1 654 bp, 包括家兔BMP7近全长前肽、全长成熟肽CDS及3′非翻译序列(3′UTR), 将已有的序列向5′和3′端分别延伸了395 bp和628 bp。序列对比表明, 克隆的家兔BMP7 CDS部分与人、小鼠的对应序列的同源性分别为91.89%和89.32%, 预测的氨基酸序列同源性分别为96.51%和96.01%。家兔BMP7 3′UTR长446 bp, 与人、小鼠对应序列同源性分别为57.38%和45.57%; 具有2个转录终止信号位点。推测家兔BMP7成熟蛋白有BMPs特有的7个位置固定的半胱氨酸残基和TGF-β家族指纹。家兔BMP7 3′UTR区转录终止信号的可选择性可能与基因转录后调控有关。     

杂交瘤细胞体外大规模培养研究进展

单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值,是免疫检验中的新型试剂,是生物治疗的导向武器。作为医学检验试剂,单克隆抗体可以充分发挥其优势,如特异性好,灵敏度高,更便于质量控制,利于标准化和规范化。传统的方法是利用小鼠腹水制备单克隆抗体,但是近几十年杂交瘤细胞体外大规模培养制备单克隆抗体技术也在不断发展。特别是单克隆抗体在疾病诊断和治疗方面的需求,更进一步促进了杂交瘤细胞体外培养生产技术的发展,体外培养杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已应用到许多方面。由于杂交瘤细胞的半贴壁性质,无论是悬浮培养还是贴壁培养,均可进行杂交瘤细胞的体外大规模培养。针对应用于体外诊断试剂的杂交瘤细胞体外培养制备单克隆抗体进行综述,主要包括中空纤维细胞培养和生物反应器细胞培养方法,以及不同培养方法优化的进展。     

HSV-IgM人-鼠嵌合抗体制备及稳定细胞株构建工艺开发

为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白。同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株。结果表明,最适筛选压力为20P200M(一轮加压)和50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为1620 mg/L和623 mg/L。本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础。     

不同信号肽对人鼠嵌合CMV-IgM分泌表达的影响

为了实现在体外制备巨细胞病毒-免疫球蛋白M(CMV-IgM)和探讨不同信号肽对CMV-IgM表达的影响,通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞基因序列,构建人鼠嵌合CMV-IgM表达载体,并通过PCR方法将5种不同的分泌型信号肽(SigA–SigE)代替CMV-IgM自身信号肽(SigF),利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞进行体外表达。对纯化后的CMV-IgM进行SDS-PAGE、SEC-HPLC和酶联免疫吸附试验(ELISA)确定其蛋白表达水平与免疫反应性,最终成功制备出910 kDa的重组蛋白,且研究表明,5种信号肽(SigA–SigE)的人鼠嵌合CMV-IgM表达量较CMV 6#细胞株自身信号肽SigF相比,分别提高了6.72、5.19、1.44、1.85、1.98倍。这将对人鼠嵌合CMV-IgM的开发提供理论基础,且为提高CMV-IgM表达量的研究工作提供了新思路。