SARS和MERS中和抗体假病毒检测方法的建立

严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)均属冠状病毒科(Coronaviridae),能够引起人类严重疾病,特别是SARS-CoV可以导致严重急性呼吸综合征,而且容易造成暴发式流行,引起社会恐慌。本研究利用含有SARS-CoV和MERS-CoV棘突蛋白(Spike protein,S)基因的表达质粒pcD-NA3.1-SS、pcDNA3.1-MS,成功构建了高滴度假病毒,在此基础上通过对病毒接种量进行优化,建立了稳定可靠的假病毒中和抗体检测方法,并通过检测SARS恢复期病人血清以及免疫后小鼠血清对方法的特异性、稳定性以及重复性进行分析,充分证明了该方法是有效的血清中和抗体的检测手段。本研究成功构建了不依赖于BSL-3级生物安全条件的SARS和MERS假病毒,不仅可应用于血清中和抗体检测,还为后续单克隆抗体及抗病毒药物筛选和评价、疫苗研发及病毒感染机制研究等奠定了基础。     

牦牛MT-I/-Ⅱ cDNA分子克隆及其蛋白质结构分析

利用基因特异引物YMTSP1和YMTSP2,通过RT-PCR从牦牛肝脏组织RNA中克隆出了牦牛MT-Ⅰ(Genbank Accession NoAY513744)和MT-Ⅱ(Genbank Accession NoAY513745)基因编码区全长.将牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ cDNA序列在CBI上进行同源性搜索发现,牦牛MT-Ⅰ/-Ⅱ编码区序列在不同哺乳动物中相当保守.牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ编码的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白分别由61个氨基酸组成,其具有保守的短肽结构如C-X-C,C-C-X-C-C,C-X-X-C等,其决定MT蛋白分子的整个三维结构,在分子进化上十分保守.同时对牦牛MT的疏水性和跨膜区分析表明,牦牛MT蛋白可能不存在跨膜区,也不存在信号肽,是1种非分泌蛋白.并通过同源比较模建,预测和构建了牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白的分子空间结构,表明牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ由α-和β-两个结构域组成,在α-结构域含有5个Cys短肽结构,β-结构域有4个Cys短肽结构,且2个结构域由保守的三肽序列KKS相连.     

牦牛MT-Ⅰ/-Ⅱ cDNA分子克隆及其蛋白质结构分析

利用基因特异引物Y_MTSP₁和Y_MTSP₂,通过RT-PCR从牦牛肝脏组织RNA中克隆出了牦牛MT-Ⅰ(GenbankAccessionNo:AY513744)和MT-Ⅱ(GenbankAccessionNo:AY513745)基因编码区全长。将牦牛MT-Ⅰ和MT-ⅡcDNA序列在CBI上进行同源性搜索发现,牦牛MT-Ⅰ/-Ⅱ编码区序列在不同哺乳动物中相当保守。牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ编码的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白分别由61个氨基酸组成,其具有保守的短肽结构如:C-X-C,C-C-X-C-C,C-X-X-C等,其决定MT蛋白分子的整个三维结构,在分子进化上十分保守。同时对牦牛MT的疏水性和跨膜区分析表明,牦牛MT蛋白可能不存在跨膜区,也不存在信号肽,是1种非分泌蛋白。并通过同源比较模建,预测和构建了牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白的分子空间结构,表明牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ由α-和β-两个结构域组成,在α-结构域含有5个Cys短肽结构,β-结构域有4个Cys短肽结构,且2个结构域由保守的三肽序列KKS相连。