麻疯树核糖体失活蛋白Curcin2的原核可溶性表达及其抗真菌活性研究

Curcin2是麻疯树幼苗在真菌侵染、干旱及高低温胁迫下诱导产生的一种核糖体失活蛋白.采用分子克隆的方法,从麻疯树基因组中扩增到Curcin2成熟肽编码基因,分别连接到质粒载体pGEX-6p-1、pMAL-c5E上,转化大肠杆菌最终获得重组菌PGC(pGEX-6p-1-curcin2)和PMC(pMAL-c5E-curcin2).在不同温度、IPTG浓度、时间诱导下,Curcin2在重组菌PGC中均以包涵体形式表达,在重组菌PMC中主要以可溶性融合蛋白形式表达,且蛋白质的表达量与诱导条件相关.重组菌PMC表达可溶性curcin2的优化条件为:温度28℃,IPTG 0.3mmol/L,时间8h,此条件下目的蛋白占总蛋白表达量的30.6％,1L培养物中可获得19.74mg电泳纯的重组蛋白.重组蛋白可被MBP TrapTM HP柱亲和纯化并与curcin抗体发生抗原抗体反应.体外抗真菌活性实验表明,纯化后的curcin2融合蛋白有抑制真菌生长作用,且对小麦赤霉、油菜菌核的抑制作用强于curcin.此蛋白的获得为其相关功能的研究奠定了基础.     

液相杂交快速检测特异DNA

检测特异DNA片段的方法中,传统Southern blot技术由于其高度可重复性及能够显示条带大小的特性,一直是DNA检测的“黄金标准”.但是杂交时间长,步骤复杂,放射性污染等问题亟待解决.为了简化Southern blot,研究使用了一种液相杂交快速检测DNA的方法,即使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的dUTP掺入探针后,在溶液中与待检测DNA样本42℃下杂交,然后琼脂糖凝胶电泳检测荧光杂交信号.利用质粒为模板,优化了探针制作、杂交液组成、杂交时间和温度等参数.在FITC-dUTP∶ dTTP比例为1∶3、模板质粒浓度为50μg、1×杂交缓冲液(25 mmol/LTris,10mmol/L EDTA,8mmol/L Nacl,PH =8.0)中95℃变性5～9 min和42℃杂交3h的实验条件下,可检出1.2μg的质粒,探针灵敏度为7.3 ng/μl.这种方法不需要转膜,曝光,大大节约了时间,简化了操作,荧光检测也为该方法同时检测多色样本提供了可能,可广泛应用于核酸检测.