棉铃虫Hsp70的多克隆抗体制备及鉴定

HSPs(热休克蛋白)是机体在不利环境条件刺激下合成的一类蛋白质,在进化上高度保守,普遍存在于生物体,其中Hsp70是最为保守的成员。研究发现,昆虫滞育过程中普遍存在Hsp70表达上调的现象。然而,现有的研究均是在基因水平的检测结果。为了能从蛋白水平检测棉铃虫中Hsp70的表达,本研究制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。构建了hsp70的原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白经镍柱纯化后免疫兔子,制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。抗体的效价较高,达到了1∶256 000,此外Western结果表明,制备的抗体能检测出热诱导的Hsp70蛋白。本研究制备了高效价且较为特异的Hsp70对克隆抗体,该抗体为后续从蛋白水平研究棉铃虫滞育过程中Hsp70的表达及其分子机制奠定了基础。     

棉铃虫中HSF1的分子克隆、选择性剪接及亚细胞定位研究

昆虫滞育过程中热休克蛋白的表达调节机制尚不明确,一个重要的原因是缺乏对其转录调控因子(热休克因子HSF1)的研究。因此,本文重点研究HSF1以期为阐明滞育昆虫中的热休克蛋白的调控机制打下基础,进而为开发新型的棉铃虫防治策略提供依据。首先,从棉铃虫中克隆了HSF1基因,对棉铃虫HSF1基因序列分析及进化树构建。随后在棉铃虫不同组织中发现了HSF1的7个选择性剪接体。最后,鉴定并分析棉铃虫中的7个HSF1的选择性剪接体,并对它们的亚细胞定位进行了研究。结果表明:棉铃虫HSF1基因的全长c DNA序列全长2 275 bp,编码一个655 aa的蛋白质,预测其分子量为72. 26 k Da,命名为Har-HSF1 (Gen Bank登录号为KP307027)。根据预测的蛋白质序列进行分析,表明棉铃虫HSF1蛋白包含4个经典的功能域:DNA结合域DBD,疏水性的七肽重复域HR-A/B,疏水性的七肽重复域HR-C以及C末端反式激活结构域CTAD。这些说明HSF1蛋白是一个在生物进化上非常保守的蛋白质。此外,发现了HSF1的7个选择性剪接体,命名为HSF1-A到HSF1-G。亚细胞定位研究表明所有的选择性剪接体都定位在细胞核中,这为它们调节靶基因提供了便利。本研究可以为进一步研究滞育昆虫中热休克蛋白的分子调控机制打下了基础。