共表达分子伴侣PDI和Ero1对葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中表达的影响

通过单独表达蛋白质分子伴侣二硫键异构酶(PDI)和共表达PDI和内质网氧化还原酶(Ero1),提高重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。将构建的蛋白质分子伴侣表达载体p PICZ/PDI和p PICZ/Ero1-PDI线性化后,电击转化重组毕赤酵母X33/p MD-GOD细胞,用含有250μg/m L G418和50μg/m L Zeocin的YPD双抗平板筛选阳性转化子,阳性转化子进行试管发酵和10 L发酵培养后,分析共表达PDI和Ero1-PDI对GOD表达水平的影响。结果显示,共表达PDI及Ero1-PDI分别使葡萄糖氧化酶在10 L发酵罐中30℃培养,酶活分别达到476 U/m L和736 U/m L,相比原始菌株在相同条件下分别提高了29.7%和100%。整合分子伴侣PDI和Ero1促进蛋白正确折叠明显地提高葡萄糖氧化酶蛋白表达。     

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达

通过体外多拷贝构建实现FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)在毕赤酵母(Pichia pastoris)X33菌株中的高效表达。将前期构建的经密码子偏好性优化FAD-GDH基因插入到pPICZαA质粒中，通过同尾酶法酶切酶连构建含1～4个表达盒的重组表达质粒，分别电转至毕赤酵母X33中，成功筛选到各种重组菌株。qRT-PCR测定结果表明，载体所含的表达盒数目与嵌合进毕赤酵母基因组中的GDH基因拷贝数之间存在正相关关系。重组菌在试管水平用甲醇诱导72 h,酶活达到最高，其中4拷贝的转化子表达水平最高；选择1拷贝和4拷贝转化子进行10 L发酵罐扩大培养，1拷贝菌株诱导108 h酶活达到最高697.125 U/mL,4拷贝菌株诱导132 h酶活达到最高1 063.279 U/mL,比1拷贝酶活提高52.52%。结果表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高FAD-GDH的表达量，为其进一步扩大生产提供参考。     

外源表达γ-内酰胺酶菌株的构建及发酵条件优化

我们构建了重组γ-内酰胺菌株E. coli BL21/pCDFDuet-γ-lactam,研究了发酵产γ-内酰胺酶的条件并进行了优化。研究结果表明,将pCDFDuet-1表达载体转化到含有γ-内酰胺酶基因的感受态E. coli中,得到重组γ-内酰胺菌株E. coli BL21/pCDFDuet-γ-lactam,通过IPTG诱导表达和HPLC检测发现,重组酶可以水解(+)γ-内酰胺,其e.e.值比E. coli BL21/γ-lactam表达提高了约30%。重组菌中(+)γ-内酰胺酶蛋白表观分子量为50 kD。对重组菌株发酵条件进行了初步研究,结果进一步表明,当选择碳源葡萄糖5 g/L、温度30℃、接种量4%、装液量100 mL/500 mL,转速180 r/min条件下,(+)γ-内酰胺酶含量最高,e.e.值约98%。本研究为探索出一条适合规模化生产的酶催化反应工艺提供参考,该工艺的意义不仅可以节约经济,而且对环境友好,可以替代化学工艺。     

基于密码子优化的FAD依赖葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

旨在获得表达量高的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶。通过FAD依赖的葡萄糖脱氢酶密码子优化,人工合成基因片段,构建重组表达载体pMD-GDH,转化毕赤酵母X33菌株后利用甲醇诱导培养实现分泌表达。结果显示,经试管水平筛选阳性转化子获得一株酶活高且稳定的重组菌株,在10 L发酵罐培养时经过136 h诱导培养,酶活达到257 600 U/L。酶学性质分析表明,以葡萄糖为底物时最适温度和pH分别为55℃和7.0,在50℃下处理150 min仍有70%的活性,在pH 4-7范围内,37℃保温4 h,FAD-GDH仍能保持50%以上的活性。金属离子Cu~(2+)对酶活抑制作用比较大。FAD-GDH的底物专一性较好,以葡萄糖为最适底物。经毕赤酵母密码子偏好性优化实现了FAD依赖的葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达,为应用于血糖检测提供理论依据。