腺病毒载体及其在基因治疗研究中的应用

腺病毒载体在基因治疗研究中初露锋芒,引起关注,文章就腺病毒基因组的基本结构、腺病毒载体的类型及构建、重组腺病毒在基因治疗研究中的应用及其主要优、缺点等方面进行了较为全面的综述．     

胆固醇逆转运相关蛋白基因在骨骼肌的表达

构建载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏＡＩ）、载脂蛋白Ｅ（ａｐｏＥ）和卵磷脂胆固醇酰基转移酶（ＬＣＡＴ）的病毒或非病毒载体,分别转染离体成肌细胞或直接注入小鼠骨骼肌,观察其表达程序及分泌人血等情况,探讨借用骨骼肌异源表达这些在胆固醇逆转运中起关键作用的重要候选基因,进而发展一种简易安全基因治疗方法的可能性。结果显示,质粒表达载体ｐＣＭＶａｐｏＥ３和重组腺病毒载体Ａｄ－ＲＳＶ－ａｐｏＡＩ在原代培养小鼠成肌细胞和成     

蛋白激酶C抑制剂Staurosporine对A类清道夫受体胞浆域结构去除后功能的影响

A类清道夫受体（scavenger receptor,SR-A）是一种主要位于巨噬细胞膜表面的同源三聚体糖蛋白,能够结合和摄取多种配基并介导内移.在清道夫受体胞浆域有几个潜在的磷酸化位点,有关这些磷酸化位点与受体功能之间的确切关系目前尚所知甚少.为深入探讨A类清道夫受体胞浆域与磷酸化之间的关系,以及受体胞浆域磷酸化对受体功能的影响,实验以含有SR-A cDNA质粒为模板,采用PCR方法扩增不含胞浆域序列的清道夫受体,同时扩增全长清道夫受体作为对照.PCR产物经纯化酶切后,进一步亚克隆到PcDNA3.1/HisB中,测序结果表明,重组产物能够编码正确的氨基酸序列.重组产物经脂质体Lipofectamine(LF2000)介导转化入CHO细胞中,在含G418选择性培养液中培养筛选14天后,分离阳性克隆, 继续培养.采用流式细胞计数仪（FACS）鉴定转化筛选后细胞能否表达具有功能的清道夫受体.结果发现,转化的CHO细胞可以稳定表达SR-A的蛋白质,但受体胞浆域去除后,摄取配基的能力明显弱于全长组（1∶1.337）.用荧光DiI标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-AcLDL),37℃孵育转化细胞5 h后,激光共聚焦显微镜下观察到：全长受体转化组细胞荧光散在分布于细胞膜和细胞器,而去除胞浆域组荧光只局限于细胞膜,说明SR-A胞浆域可能起着介导受体内移的作用.进一步比较蛋白激酶C抑制剂星形孢菌素(staurosporine,STA）对两组细胞受体功能的影响,发现经STA处理后,全长组受体与配基的结合及摄取明显增高,而胞浆域去除后受体不受STA的调控.从而证明磷酸化药物可能是通过改变SR-A胞浆域磷酸化水平而发挥作用,受体胞浆域磷酸化可能决定着受体的内移,并参与调节受体的活性.     

冠心病患者血浆和肽素、白细胞介素18的表达及临床意义

目的:探讨血浆hs-CRP、IL-18及和肽素(copeptin)与冠心病类型的关系及临床意义.方法:36例对照组,41例稳定型心绞痛(SA)组,43例不稳定性心绞痛(UA)组,48例急性心肌梗死(AMI)组,均符合缺血性心肌病的诊断标准.采用免疫比浊法测定hs-CRP水平;采用放射免疫法测定血浆和肽素;采用双抗体夹心ELISA法测定血浆IL-18水平.结果:UA组与AMI组WBC、NEU、hs-CRP、IL-18、和肽素水平显著高于正常对照组(P＜0.05);与UA组比较,AMI组的hs-CRP、IL-18水平显著升高;IL-18与TG、LDL-c、hs-CRP及和肽素呈正相关(P＜0.05),与HDL-c呈负相关(P＜0.05).结论:血浆和肽素与IL-18水平随着冠心病严重程度的增加而升高,其水平变化对冠心病的诊断、病情的严重程度、临床危险分层具有一定的临床意义.     

重组腺相关病毒载体介导的apoA—I和／或LCAT在肌源性细胞中的表达

卵磷脂胆固醇酰基转移酶 (lecithincholesterolacyltransferase,LCAT)是产生血浆中大部分胆固醇酯 (CE)的主要酶 ,并且是胆固醇逆转运 (reversecholesteroltransfer,RCT)中的一个关键因子。将含有人apoA I和 /或LCATcDNA的rAAVAIL/rAAVL表达载体与 pDG质粒经磷酸钙共沉淀法转导入 2 93T细胞中 ,包装为重组腺辅助病毒 (rAAV) ;以Iodixanol密度梯度离心 ,继以肝素亲和层析等方法分离、纯化及浓缩rAAV ;斑点杂交鉴定制备的rAAV颗粒数达 7× 10 14 个 /L(rAAVAIL)和 1× 10 14 个 /L(rAAVL)。以rAAVAIL/rAAVL转染小鼠肌源性细胞C2C12 ,经ELISA、Western印迹和 [3 H] 胆固醇标记底物的放射化学方法结果分别表明 ,apoA I、LCAT在转染细胞中持续 30天表达 ;分化为多核的肌管细胞后 ,仍保持这种表达能力。PCR结果表明 ,目的基因已整合入细胞基因组。以rAAV为载体 ,能有效介导人LCAT、apoA I基因在肌源性细胞中表达 ,并分泌至细胞外     

集落刺激因子与动脉粥样硬化

集落刺激因子（ＣＳＦｓ）可通过激活ＬＤＬ受体依赖性和非依赖性途径，使含ＡＰＯＢ－１００的脂蛋白水平降低。另一方面，动脉壁内ＣＳＦｓ则吸引循环单核细胞而聚集、衍化为巨噬细胞，并增强其摄取脂蛋白和酯化胆固醇的能力。提示ＣＳＦｓ对动脉粥样硬化可能具有抑制和促进双重作用。对ＷＨＨＬ兔的整体实验显示，Ｍ－ＣＳＦ能减缓其自发性动脉粥样硬化的进程。对ＣＳＦｓ的进一步研究可能有助于加深对动脉粥样硬化发病机理的认识，进而开辟防治新途径。