猪细小病毒自然弱毒N株VP2基因的克隆、测序及生物信息学分析

本研究对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)自然弱毒N株(PPV-N)VP2基因进行克隆、测序并利用生物信息学技术分析PPV-NVP2蛋白基因的同源性、遗传进化、密码子偏爱性、糖基化位点、磷酸化位点、B细胞抗原表位及其二、三级结构。结果表明:成功扩增出包含VP2基因完整目的片段(1901bp),构建了VP2基因的克隆重组质粒pMD18-T-VP2,测序获取VP2基因序列(1740bp)并将该序列登录到GenBank(HM355807)。PPVVP2基因属高度保守的基因;PPV-N株与PPV弱毒代表毒株NADL-2株亲缘性近,推测PPV-N株属于弱毒株;PPV-N株VP2基因氨基酸密码子偏爱以A结尾的密码子;PPV-N株VP2蛋白可能存在7个糖基化位点,其丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸可能分别有9、7、8个磷酸化位点,可能存在24个B细胞抗原表位;PPV-N株VP2蛋白二级结构预测,α-螺旋占11.74%,β-折叠占22.97%,无规则卷曲占65.28%,而三维结构预测VP2蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个螺旋和折叠区域。本研究结果为进一步阐释PPV-N株自然弱毒的分子机理提供依据,并为PPV分子诊断试剂及基因工程疫苗研究等提供有益借鉴。     

广西14市猪戊型肝炎的分子流行病学分析

为调查广西猪戊型肝炎(HE)的感染情况,本研究应用套式RT-PCR方法对采自广西14市43个猪场的508份3月龄左右猪只粪样及市售182份猪肝扩增猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因特异序列,并进行核苷酸序列同源性分析及遗传进化分析。结果表明,在508份猪粪样中194份可以检测到HEV RNA,阳性率为38.2%;182份猪肝样本中,33份可检测到HEV RNA,阳性率为18.1%;43个猪场中检出HEV RNA的有35个,猪场阳性率为81.4%。所获取的39株广西猪HEV ORF2基因特异序列同源性为89.9%～100%,提示在所调查的广西猪场中已较普遍存在HEV感染,所获取的39株广西HEV阳性样品均属于基因Ⅳ型。本研究结果佐证了感染猪及市售带毒猪肝脏是HEV重要的储存库和传染源,应该重视其公共卫生学意义,预防粪-口途径或者食源性HEV感染。     

尼罗罗非鱼ZAP-70蛋白的原核表达、纯化及其多抗制备

[目的]构建尼罗罗非鱼ZAP-70原核表达载体,纯化其重组蛋白并制备多克隆抗体。[方法]采用无缝克隆技术构建尼罗罗非鱼ZAP-70重组表达载体,并转入大肠杆菌B21中诱导表达,将表达的ZAP-70蛋白免疫日本大耳兔得到多克隆抗体,采用Western Blotting和ELISA技术鉴定抗体的特异性和效价。[结果]成功构建原核表达重组质粒p ET-B2m-ZAP-70,诱导表达的重组蛋白分子量约为39 k Da,主要以包涵体的形式表达;获得效价为1∶512 000的多克隆抗血清,WB检测显示该抗体能够特异性的识别所表达的ZAP-70重组蛋白。[结论]尼罗罗非鱼ZAP-70重组质粒在大肠杆菌B21中高效表达,分子量约为39 k Da,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步探索ZAP-70在尼罗罗非鱼免疫系统中的功能奠定了基础。