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文中拟通过采用基因重组技术获得ALT1和ALT2同工酶重组蛋白,分别制备筛选出高特异性、高活性的ALT1和ALT2单克隆抗体 (ALT1单克隆抗体已成功制备并发表),初步探讨ALT1和ALT2同工酶在人体组织中的定位、分布及表达情况。采用RT-PCR方法从人肝癌细胞 (HepG2) 中扩增ALT2基因,将成熟的ALT2基因亚克隆至pET32a-ALT2原核表达载体中,并将其连接产物转化至BL21(DE3) 感受态细胞中经IPTG诱导表达ALT2蛋白,镍柱 (Ni+) 亲和层析法纯化ALT2重组蛋白。ALT2重组蛋白免疫Balb/c小鼠,选取阳性血清小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,间接ELISA法挑选阳性细胞株,有限稀释法进行亚克隆,采用亲和层析柱法纯化ALT2抗体。通过RT-PCR和Western blotting方法检测ALT1和ALT2在人体正常组织中的表达和分布,研究结果显示组织中的ALT同工酶基因在mRNA水平和蛋白水平上的表达几乎一致。ALT1在肝脏、肾脏、骨骼肌高表达,胃肠道平滑肌中等表达;ALT2在脂肪、骨骼肌、心肌中高表达,胃肠道平滑肌低表达。免疫组化研究表明,ALT1在肝细胞、肾髓质小管和肌纤维中高表达,ALT2在脂肪细胞、心肌细胞中高表达,胃肠道组织ALT1和ALT2主要表达于肠壁上部区域黏膜,上述结果显示同工酶ALT1和ALT2在组织中分布广泛,为理解不同病理条件下ALT活性升高的变化机制提供理论依据。 相似文献
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