蛹虫草磷酸甲羟戊酸激酶和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的功能分析

【目的】确定蛹虫草甲羟戊酸途径中的2个关键酶——磷酸甲羟戊酸激酶(CmErg8)和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(CmErg19)的功能及其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【方法】通过生物信息学分析鉴定蛹虫草中CmErg8和CmErg19,并采用酵母互补确定其功能是否保守;以蛹虫草尿嘧啶营养缺陷型CmΔpyrG为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对CmErg8和CmErg19进行过表达,观察其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【结果】CmErg8和CmErg19不能互补酵母erg8和erg19突变体的温度敏感表型;CmErg8和CmErg19过表达菌株中麦角甾醇和虫草素含量均有所增加,特别是CmErg19基因过表达可以使虫草素含量提升5倍左右。【结论】本研究揭示了蛹虫草CmErg8和CmErg19的功能,并且发现蛹虫草麦角甾醇合成通路基因可能会影响虫草素含量。     

米曲霉尿嘧啶营养缺陷型突变体筛选及转化体系建立

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种十分重要的工业微生物，但由于其菌丝体和孢子均含有多个细胞核，并且对多种抗性药物具有抗性，导致其遗传转化和分子生物学研究较其他模式丝状真菌困难。目前米曲霉遗传转化主要采用营养缺陷型作为筛选标记。尿嘧啶营养缺陷型是米曲霉转化中最常用的一种营养缺陷型标记，其筛选标记基因pyrG编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶为尿嘧啶的前体尿苷合成所必需。本研究以米曲霉3.042为背景，利用紫外线诱变和5-氟乳清酸(5-FOA)胁迫筛选获得5株尿嘧啶营养缺陷型菌株，经DNA测序5株菌株均为pyrG基因不同位点突变，确定为尿嘧啶营养缺陷型。以筛选到的尿嘧啶营养缺陷型菌株为背景，利用农杆菌介导的米曲霉转化系统，成功构建了米曲霉尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌转化体系。     

农杆菌介导的蛹虫草营养缺陷型菌株和遗传转化体系的构建

【背景】天然蛹虫草是蛹虫草菌侵染昆虫蛹或虫形成的子实体,具有非常重要的生物药理活性。目前蛹虫草基因组测序已经完成,但是其分子生物学研究较少。【目的】在蛹虫草中构建一种以尿苷/尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌介导的转基因体系。【方法】乳清酸核苷-5′-磷酸（orotidine-5′-monophosphate,OMP）脱羧酶为尿嘧啶合成必需酶,利用根癌农杆菌介导的转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）方法,通过同源重组对蛹虫草野生型菌株中该酶的编码基因pyrG进行敲除,构建尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体。然后,利用本实验室已有的米曲霉pyrG为筛选标记的二元转化载体,通过农杆菌转化法对该营养缺陷型菌株进行遗传转化。【结果】通过同源重组法,成功敲除pyrG构建了尿嘧啶营养缺陷型蛹虫草,以此为背景,在22℃共培养66h,成功对蛹虫草实现转基因,转化效率为（75±35）/10⁶孢子。另外,本研究还发现丝状真菌常用的构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA及α淀粉酶启动子PamyB不能在蛹虫草...