固定化细胞拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的研究

【目的】筛选鉴定一株产酯酶用于选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,利用该菌株固定化细胞催化拆分外消旋底物。【方法】通过富集培养、罗丹明B平板初筛及复筛培养获得一株选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,通过对其形态、生理生化特征及16S r DNA序列分析,确立该菌株系统发育地位。优化了利用硅藻土-戊二醛吸附交联法对该菌体细胞固定化的条件,研究固定化细胞催化性质及操作稳定性。【结果】该菌为革兰氏阴性菌,鉴定其为甲基球状菌属(Methylopila)。固定化体系最优条件:聚乙烯亚胺0.15%(V/V),戊二醛0.2%(V/V),硅藻土6 g/L,菌体质量浓度100 g/L。与游离细胞相比,固定化细胞最适p H由8.0变为8.5,最适温度由35°C变为40°C,p H稳定性和温度稳定性都有所提高。Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)能促进酶活,Zn~(2+)、Fe~(2+)抑制酶活。固定化细胞的有机溶剂耐受性较游离细胞有所提高。动力学分析细胞固定化后Km值变大,底物亲和力降低。利用固定化细胞水解(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯,底物浓度200 g/L,反应20 h,保留构型为S型,得率47.8%,对映体过量值ees为99.4%,重复使用12次后仍保留初始酶活的80%以上。【结论】开发了利用Methylopila sp.cxzy-L013固定化细胞择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的工艺,该工艺具有良好的工业应用前景。     

环氧树脂固定化L-谷氨酸氧化酶

通过环氧树脂作为载体对经(NH4)2SO4盐析处理后的L-谷氨酸氧化酶(LGOX)进行固定化,优化固定化工艺条件,并利用固定化LGOX转化产α-酮戊二酸(α-KG)。结果表明:饱和度45%的(NH4)2SO4为最佳盐析浓度;当选用环氧树脂ES-105作为固定化载体、树脂加量为20 m L酶液(14 U/m L)加入3.5 g载体、固定化K3PO4缓冲液浓度为0.2 mol/L(p H 7.0)、固定化温度25℃、固定化时间24 h时,固定化LGOX酶活力最高,其酶活回收率为85.9%,比酶活55.7 U/g。利用该固定化酶转化L-谷氨酸产α-KG,当谷氨酸钠质量浓度为100 g/L,反应20 h,产物收率达98.2%。固定化酶重复使用14批次后,产物收率仍有90%以上;重复使用20批,收率有83.2%。因此,该固定化酶具有具良好的操作稳定性。     

亮氨酸脱氢酶偶联NADH再生体系合成L-2-氨基丁酸

文中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,构建两株分别共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/甲酸脱氢酶(FDH,来源水生弯杆菌)和亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/醇脱氢酶(ADH,来源红球菌)的重组大肠杆菌。通过偶联两种不同NADH再生体系,以L-苏氨酸为起始原料,利用苏氨酸脱氨酶(L-TD)与LDH-FDH或LDH-ADH一锅法合成L-2-氨基丁酸,并对LDH-FDH工艺和LDH-ADH工艺进行对比优化。LDH-FDH工艺的最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃,通过加入50 g/L甲酸铵、0.3 g/L NAD+、10%LDH-FDH粗酶液(V/V)和7 500 U/L的L-TD酶液,对L-苏氨酸进行分批补加,以便控制2-丁酮酸浓度小于15 g/L,反应28 h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为161.8 g/L,产率97%。LDH-ADH工艺的最适pH为8.0,最适反应温度为35℃,通过加入0.3 g/L NAD+、10%LDH-ADH粗酶液(V/V)及7 500 U/L的L-TD酶液,分批补加L-苏氨酸及1.2倍摩尔量异丙醇,以便控制2-丁酮酸浓度小于15g/L,且每生成约40g/L的L-2-氨基丁酸,抽真空去除丙酮,反应24h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为119.6 g/L,产率98%。文中所采用的工艺及结果可为L-2-氨基丁酸的工业化提供一定的参考依据。