土壤中群体感应淬灭细菌的原位分离与筛选

【背景】许多革兰氏阴性细菌通常以N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs)作为群体感应主要的信号分子。【目的】从土壤中筛选和鉴定新型群体感应淬灭细菌。【方法】通过"垫圈法"从土壤中原位培养分离细菌,采用琼脂条法、报告菌平板法及β-半乳糖苷酶活性测定筛选群体感应淬灭细菌,根据16S rRNA基因序列同源性分析确定菌株系统发育地位。【结果】从不同地区土样中原位培养共分离获得细菌502株。以根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4)作为报告菌,最终得到11株具有较强降解AHLs能力的细菌,包括假单胞菌5株、不动杆菌4株、变形杆菌和莱茵海默氏菌各1株。大部分细菌可完全降解N-3-羰基十二酰基高丝氨酸内酯(3OC12-HSL),部分细菌对N-(3-氧代己酰)高丝氨酸内酯(3OC6-HSL)和N-3-氧代辛酰高丝氨酸内酯(3OC8-HSL)具有一定降解活性。【结论】Proteus和Rheinheimera可降解AHLs,为今后防治依赖群体感应的植物细菌病害提供新型生防资源。     

本氏烟PP2A亚基基因的表达模式和克隆

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)由结构亚基A、催化亚基C和调节亚基B组成,控制生物体内多种生命代谢过程,但目前尚不清楚其在植物抗病中的作用。本研究利用拟南芥、普通烟草、番茄和水稻PP2A的亚基序列,比对分析获得本氏烟(Nicotiana benthamiana)中对应的亚基序列。利用实时定量RT-PCR技术,分析了6个亚基基因在辣椒疫霉侵染本氏烟阶段(灌根后8、24、72 h)以及2个结构亚基基因在本氏烟不同组织部位(根、茎、叶、花和种子)中的转录水平。结果发现,在病原物侵染时,多数基因均显著上调表达,Nb PP2Ac-4在侵染阶段的表达量显著高于其他基因;2个结构亚基基因(Nb PP2Aa-1和Nb PP2Aa-2)在茎、叶、花和种子中的表达量均显著高于在根部中的表达量。克隆获得本氏烟和辣椒中2个结构亚基基因的全长c DNA序列,它们的二级结构主要为α和η螺旋,含有保守的功能域,与其他植物和人的结构亚基具有很高的同源性。     

我国不同产区桃褐腐病病原鉴定与分析

【背景】桃褐腐病是桃树的一种重要病害,给桃果生产带来了严重的经济损失。桃褐腐病病原种类较多。【目的】明确我国不同桃产区褐腐病菌的种类。【方法】采集不同产区桃褐腐病果,采用单孢分离法分离病菌,通过形态特征、分子生物学方法和接种试验对分离株进行种类鉴定和分析。【结果】从来自浙江丽水、四川成都、云南昆明、辽宁大连、河北石家庄、北京海淀、山东泰安和山东青岛等8个不同桃产区的褐腐病果上经单孢分离获得15株分离株。各分离株菌落形态略有差异,但来自云南的分离株hfyn与其他分离株明显不同。通过rDNA ITS序列和系统进化树分析,将云南分离株hfyn鉴定为云南丛梗孢(Monilia yunnanensis),来源于其他产区的14株分离株均鉴定为果生链核盘菌(Monilinia fructicola)。采用多对特异性引物PCR扩增分析,确证了上述鉴定结果。接种试验表明,不同产区来源的桃褐腐病菌分离株在桃果上的致病力存在差异,其中来自浙江丽水、河北石家庄、山东青岛的分离株致病力较强,而来自山东泰安和云南昆明的分离株致病力相对较弱。【结论】我国桃产区褐腐病菌主要以M.fructicola为主,但不同产区来源的菌株间存在形态和致病性差异,此结果可为我国桃褐腐病的治理提供科学依据。     

辣椒疫霉RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性、基因转录特征及功能

【目的】分析辣椒疫霉中RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性,研究该效应子在辣椒疫霉生长发育和侵染阶段的转录特征及其生物学功能。【方法】本研究通过高保真扩增,分析2个烟草疫霉、1个恶疫霉和31个辣椒疫霉菌株的PcAvh2序列;提取辣椒疫霉菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发休止孢和7个侵染时间点(1.5、3、6、12、24、36、72 h)的本氏烟根部总RNA,利用RT-qPCR分析PcAvh2的转录表达水平;利用PVX瞬时表达系统,分析PcAvh2是否抑制6种效应子(BAX、INF1、PsojNIP、PsCRN63、PsAvh241、R3a/Avr3a)激发的植物免疫反应;利用CaCl_2-PEG介导的原生质体稳定转化技术,沉默PcAvh2基因,分析辣椒疫霉致病力的变化。【结果】PcAvh2为典型的RXLR效应子,在辣椒疫霉群体中该效应子具有10个等位基因,而且烟草疫霉和恶疫霉中也存在该效应子。该基因在辣椒疫霉的侵染阶段上调表达,它能够抑制6种效应子激发的植物免疫反应,进一步研究发现基因沉默导致辣椒疫霉的致病力显著下降。【结论】RXLR型效应子PcAvh2是辣椒疫霉中一个重要的侵染致病因子。     

辣椒疫霉质外体疏水小蛋白SCR82编码基因的转录特征、异源表达和功能

【目的】分析PcF/SCR质外体疏水小蛋白SCR82编码基因在辣椒疫霉生长发育和侵染寄主阶段的转录特征,克隆其cDNA和基因组全长序列,分析蛋白性状及其序列保守性,利用大肠杆菌表达并获得纯化蛋白,分析其生物学功能。【方法】提取辣椒疫霉菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发休止孢和7个侵染时间点(1.5、3、6、12、24、36、72 h)的本氏烟根部总RNA,利用半定量RT-PCR分析scr82的转录表达水平;通过高保真PCR从萌发休止孢cDNA和基因组DNA中克隆出该基因全长序列;利用软件对SCR82进行生物信息学分析,挖掘其他物种中的同源序列,预测蛋白性状;将c DNA全长序列克隆到含6×His-SUMO序列的p ET28a(+)中,在不同温度(22、37°C)和IPTG浓度(0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L)组合条件下利用大肠杆菌Rossette 2菌株表达该蛋白,利用Ni~(2+)亲和层析柱纯化蛋白;将蛋白浸润本氏烟和拟南芥叶片,分析它是否引起植物细胞死亡,蛋白浸润12、24h后利用RT-qPCR分析本氏烟中3个抗性相关基因(NbMC1、NbSOD、NbPOX)的表达量变化。【结果】scr82基因在辣椒疫霉萌发休止孢和侵染寄主阶段上调表达;该基因为辣椒疫霉中单拷贝基因,不含内含子,开放阅读框为249 bp;预测其编码82个氨基酸,包含长度为21个氨基酸的信号肽序列和7个半胱氨酸但不含有任何已知功能域,蛋白疏水性强,二级结构主要为α-螺旋和不规则卷曲,在疫霉菌中保守;含重组质粒的菌株在22°C经0.2 mmol/L的IPTG诱导过夜(～16 h)产生大小约24 kDa的融合蛋白,纯化获得30 mg/mL的可溶性蛋白;融合蛋白不引起本氏烟和拟南芥叶片的细胞死亡,但导致本氏烟抗性相关基因均上调表达。【结论】本研究获得了辣椒疫霉胞外疏水小蛋白SCR82的原核表达蛋白,该蛋白不引起植物细胞死亡,但触发植物的防卫反应。