大规模高通量方法在蛋白质相互作用研究中的应用

随着后基因组时代的到来,阐明蛋白质间相互作用关系成为蛋白质研究的又一热点,促进了相关技术的不断产生、发展和完善.其中涉及到诸多大规模高通量的方法,如双杂交系统、噬菌体展示、质谱、蛋白质芯片以及生物信息学等,这为系统分析蛋白质相互作用提供视点,有望在蛋白质组学研究中发挥重要作用.每种方法各有其优缺点且适用范围不同,在一定程度上各方法的实验结果互为补充.现拟就这些大规模高通量方法的研究进展及其在蛋白质相互作用研究中的应用作一综述.     

蛋白激酶AMPK的研究进展

AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)广泛存在于真核细胞中,一旦被激活,即可磷酸化下游靶蛋白,关闭消耗ATP的合成代谢途径,开启产生ATP的分解代谢途径,被称为“细胞能量调节器”。许多新的下游靶蛋白的发现也为AMPK生物学效应的阐明提供了新思路。     

AMP激活的蛋白激酶α2亚基在大肠杆菌中的克隆及表达

目的:AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在脑内作为多功能能量感受器发挥作用,主要协调代谢和能量的需要。脑神经元中AMPKα2亚基的含量明显高于α1亚基,本研究选择α2亚基作为对象,研究其在大肠杆菌中的表达情况,为以蛋白原核表达为前提的研究技术的应用提供实验依据。方法:大鼠AMPKα2蛋白编码区片段通过PCR方法从重组pcDNA3质粒中扩增后,克隆至带有λcI基因的pBT载体,构建融合表达载体pBT-AMPKα2。通过核苷酸序列测定证实结果正确后,转化pBT-AMPKα2入大肠杆菌XL-1 Blue MR菌株,IPTG诱导目的蛋白表达。结果:Western blotting显示AMPKα2-λcI融合蛋白表达,分子量约为89ku,与预期相符合。结果还表明AMPKα2-λcI融合蛋白以可溶性蛋白和不溶性包涵体两种形式存在,前者不稳定易发生降解,生成AMPKα2和λcI蛋白,分子量分别是62ku和27ku;后者稳定不发生降解。结论:AMPKα2亚基能以AMPKα2-λcI融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达,这为今后以pBT-AMPKα2融合表达载体为工具利用大肠杆菌双杂交系统筛选AMPKα2的相互作用蛋白奠定基础。