浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。     

层粘连蛋白促进实体型瘤细胞粘着、铺展及~3H-TdR参人

 恶性肿瘤细胞或粘着于基膜以及在一定的基质上增殖对于肿瘤的浸润转移至关重要。层粘连蛋白(1aminin,LN)是基膜所特有的非胶原糖蛋白。我们研究了LN在肿瘤细胞粘着、铺展及增殖中的作用。通过测定粘着细胞所释放的LDH活性定量分析细胞粘着率。LN可显著增加体外培养的小鼠S180-V肉瘤及B16-MBK黑色素瘤细胞在玻璃及Ⅳ型胶原基质上粘着及铺展。纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)亦有类似作用。而非糖蛋白(牛血清清蛋白)或其他糖蛋白(鸡卵清清蛋白或免疫球蛋白)均无类似作用。此外,LN或FN抗体可分别抑制细胞粘着于LN或FN。这些结果表明LN或FN促细胞粘着作用是专一性的。扫描电镜观察表明,粘着在LN敷盖的玻璃表面的瘤细胞呈多突扁平形、膜皱襞及微绒毛十分稀少,而粘着在裸露的玻璃表面者为球形,膜皱襞及微绒毛甚多。再者,~3H-TdR向粘着于LN基质上的瘤细胞群的参入量显著高于粘着在裸露玻璃面者。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒激肽释放酶Ⅰ酶解产物激肽的鉴定

至今已知的蛇毒激肽释放酶作用于激肽原后都释放舒缓激肽,仅食鱼蝮(Agkistrodon piscivorus piscivorus)蛇毒激肽释放酶既释放舒缓激肽,又释放胰激肽(Iwanaga,1979)。今对浙江蝮蛇毒激肽释放酶Ⅰ作用于激肽原后的产物作了鉴定,证实也是舒缓激肽。因此蝮蛇毒激肽释放酶不同于哺乳动物的组织激肽释放酶,后者释放胰激肽(Fiedler,1979)。