一株海洋来源铜绿假单胞菌Gxun-7角蛋白酶基因的克隆、表达及重组酶酶学性质

【背景】角蛋白酶是一类特异性降解角蛋白的水解酶,在动物饲料、生物肥料、医学、洗涤、制革及环境治理等方面具有重要的应用潜力。【目的】对前期从海洋环境筛选出的一株铜绿假单胞菌Gxun-7的角蛋白酶基因进行克隆、表达,并探究重组酶酶学性质,为角蛋白酶在工业生产中的应用奠定基础。【方法】以铜绿假单胞菌Gxun-7基因组推定的角蛋白酶基因为基础,设计引物克隆获得角蛋白酶基因kp2,构建重组表达质粒pET22b-kp2,并转化到E. coliRosettagamiB (DE3)中进行诱导表达,同时对重组表达菌株的表达条件进行优化。利用镍柱分离纯化重组角蛋白酶并研究其酶学性质。【结果】重组角蛋白酶的分子量约为33 kDa,最适温度和pH值分别为40 ℃和8.0,在温度30-60 ℃和pH 6.5-8.0具有较好的稳定性。金属离子Co²⁺、Cu²⁺和化学试剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfonate,SDS)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)对酶活力有抑制作用,而Mg²⁺、K⁺、巯基乙醇和二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)对酶活力有促进作用。重组角蛋白酶具有良好的耐盐性,在12.5%的NaCl作用下相对酶活为87.55%。以酪蛋白为底物时,酶的K_m值为60.92 mg/mL、V_max值为9.70 U/mL。【结论】海洋来源铜绿假单胞菌Gxun-7的重组角蛋白酶具有良好的温度、碱、盐稳定性,可应用于工业生产中。     

一株可高效降解羽毛的铜绿假单胞菌的分离、鉴定、产酶条件优化及其酶活研究

【目的】筛选海洋环境产角蛋白酶菌株,研究其发酵条件及酶学性质,为后续开发和利用海洋微生物降解废弃羽毛提供菌种资源和理论依据。【方法】采集广西北部湾某海鸭养殖场淤泥,用酪蛋白平板初筛和角蛋白酶活复筛获得羽毛降解效果好的菌株,并进行形态学和分子生物学鉴定;利用单因素和正交试验对菌株产酶条件进行优化,最后对酶学性质及羽毛降解产物的游离氨基酸组成进行研究。【结果】筛选到1株可高效降解羽毛的菌株,经鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa Gxun-7)。最佳产酶条件为：羽毛25 g/L,Zn2+0.10 g/L、初始pH 8.0、发酵温度32.5°C、发酵时间48 h,酶活力达124.03 U/mL,较优化前提高了2.3倍;酶学性质分析表明,该角蛋白酶最适作用温度和pH分别为70°C和8.0,化学试剂巯基乙醇可使酶活提高6.16倍,而苯甲基磺酰氟(PMSF)使相对酶活降至15.00%,该酶耐盐性较好(20%NaCl中相对酶活为74.29%);羽毛降解产物中检测到16种氨基酸,7种为必需氨基酸,总的游离氨基酸含量高达2 329.80 mg/L,其中缬氨酸含量最高为575....     

皮肤组织工程支架材料

皮肤组织工程支架材料为种子细胞提供生长和代谢的环境,是人工皮肤研究中的重要内容,可按来源分为合成支架材料和天然支架材料。近几年的研究重点是:前者通过表面仿生技术增强其对细胞的黏附性;后者通过物理或化学方法提高其力学性能和渗透性等。今后应重点研究以下内容:深入研究合成支架材料的表面改性,进一步提高其引导细胞行为的功能,促进材料对细胞的黏附;进一步提高天然支架材料的微观渗透性和生物活性,促进毛细血管的长入;制备结构仿生支架材料及高活性复合支架材料。