脓肿分支枝杆菌embB基因耐乙胺丁醇的分析

目的 分析脓肿分支枝杆菌的embB基因,以探讨其耐乙胺丁醇的分子机制.方法 用16S rRNA基因序列分析法鉴定5株脓肿分枝杆菌临床株,测定乙胺丁醇对临床株及标准株( ATCC 19977)的最低抑菌浓度(MIC).PCR扩增embB基因的全序列,将所测序列进行生物信息学分析.结果 乙胺丁醇对5株脓肿分支杆菌标准株和临床株的MIC均为128μg/mL.,属高度耐药.从脓肿分支枝杆菌的标准株和临床株均扩增出约3200 bp片段,与GenBank中脓肿分支枝杆菌标准株的embB基因大小一致.5株临床株与标准株比较,其核苷酸序列存在9个点突变,在突变位点所编码的氨基酸序列中,仅第18位、87位、770位密码子编码与标准株不同的氨基酸.6株脓肿分支枝杆菌的embB基因与对EMB敏感的结核分支杆菌标准株(H37RV)的相应基因序列比较,第303-305位密码子的核苷酸序列存在差异,但仅第303、304位核苷酸编码的氨基酸序列不同,第306位密码子的核苷酸序列无差异.结论 脓肿分支杆菌对乙胺丁醇的耐药并非embB基因的突变所致,为embB基因天然存在结构的不同,属于天然耐药.结构的差异与第306位密码子无关,可能与第303、304密码子有关.     

肺炎链球菌pbp2b和pbp1a基因突变与青霉素耐药的相关性研究

目的探讨耐青霉素肺炎链球菌pbp2b和pbp1 a基因的突变与青霉素耐药的关系,为明了肺炎链球菌的耐药性变异机制,防治其感染提供实验依据。方法从呼吸道感染患儿痰标本中分离肺炎链球菌163株,液体培养基连续稀释法测定其对青霉素的最小抑菌浓度(M IC),套式聚合酶链反应(nPCR)扩增pbp2b和pbp1 a基因,扩增产物直接DNA测序,所测序列与青霉素敏感株(SPN R6)的基因序列进行比较,并分析其氨基酸结构的改变。结果 163株肺炎链球菌中检出青霉素敏感菌75株,中度敏感17株,青霉素耐药菌71株(44%)。耐药菌中58株存在pbp2b突变(81.7%),其中,56株为点突变,2株为CCT插入突变;在27株有pbp2b基因突变的B型和C型耐药菌中,21株出现了不同程度的pbp1 a基因突变。PBP2B氨基酸结构改变以苏氨酸变为丙氨酸、精氨酸变为赖氨酸为主,PBP1A以丙氨酸变为苏氨酸、谷氨酸变为天门冬氨酸为主。结论肺炎链球菌的pbp2b和pbp1 a基因突变与对青霉素的耐药性密切相关,PBP2b突变导致低水平耐药;PBP2b和PBP1A突变导致高水平耐药。     

肠产毒性大肠埃希菌F4ac菌毛蛋白FaeG亚单位的原核表达及免疫学鉴定

目的克隆并表达肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG,为制备预防幼畜ETEC感染的疫苗奠定基础。方法以ETEC（C83902）基因组DNA为模板,PCR扩增faeG基因,插入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建重组质粒pGEX-faeG。将pGEX-faeG转化大肠埃希菌BL-21I,PTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Western blot鉴定其抗原性。将表达菌超声破碎后离心提取包涵体制备抗原,经口灌喂免疫小鼠,检测小鼠血清中抗FaeG的IgGI、gA,鉴定其免疫原性。结果扩增的faeG基因全长786 bp,与基因文库中的faeG基因同源性达96%。重组质粒pGEX-faeG经PCR及双酶切鉴定确有插入片段,且序列完整。表达产物FaeG相对分子质量约53 kD,主要存在于碎菌后的沉淀中,以包涵体形式表达。Western blot显示该蛋白可与ETEC F4ac阳性血清特异性结合,免疫后小鼠血清抗FaeG IgGI、gA明显高于PBS和GST对照组。结论成功构建了ETEC F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG的重组质粒pGEX-faeC,表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制预防幼畜ETEC感染的疫苗。     

地塞米松降解新基因的探讨

探讨地塞米松降解代谢新基因,为构建高效、稳定的地塞米松降解基因工程菌提供思路。