siRNA表达载体稳定沉默肺癌A549细胞MEKK3基因的细胞株建立

目的构建人MEKK3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体并建立稳定沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株。方法设计并合成针对人MEKK3基因4个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以BamHI及Hindm酶切位点分别克隆入pSilencer4．1-CMVhygro载体,测序鉴定后以脂质体分别转染入A549细胞,Western印迹检测它们对MEKK3表达的抑制,并选择抑制效率最高的表达载体转染入A549细胞,潮霉素筛选后获得含该载体的抗性细胞克隆株,荧光实时定量PCR检测该细胞克隆株中MEKK3表达抑制。结果测序鉴定表明4个MEKK3siRNA表达载体正确无误;Western印迹结果显示对MEKK3的表达有抑制作用,其中pSilencer4．1-MEKK3siRNA2的抑制率达84％;荧光实时定量PCR结果表明,pSilencer4．1-MEKK3siRNA2可稳定沉默MEKK3mRNA的表达,有效率达83％。结论成功地构建了针对人MEKK3基因的siRNA表达载体,并成功地建立了能高效且稳定地沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株。     

MEKK3稳定表达细胞株的建立及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建人MEKK3基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对肺腺癌细胞增殖的影响.方法 从A549细胞中提取总RNA,应用RT-PCR扩增MEKK3 cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/hygro（＋）质粒中,构建成MEKK3基因的真核表达载体,然后转染入人肺腺癌A549细胞中,潮霉素筛选稳定转染克隆,通过MTT实验,研究转染MEKK3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误,Western印迹检测结果显示MEKK3基因在A549细胞中具有良好的表达;荧光实时定量PCR结果表明MEKK3基因在其稳定转染的A549细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT结果显示MEKK3表达上调的稳定克隆组,A549细胞的增殖活性显著增强（A570=0.876 1±0.074 5）,明显高于空载体稳定转染组（A570=0.582 8±0.070 3）及未转染亲代细胞组（A570=0.584 9±0.035 2）,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 MEKK3表达上调可导致肺腺癌细胞的增殖增强.     

兔脑皮质静脉闭塞后脑组织Caspase-3活性的变化

目的观察兔脑皮质静脉闭塞后Caspase-3活性的变化。方法采用电凝法制作兔脑皮质引流静脉急性闭塞模型,琼脂糖凝胶电泳、荧光实时定量PCR和Western印迹检测Caspase-3表达。结果脑皮质静脉闭塞后8hCaspase-3活性已升高,24h达高峰,48h明显下降。结论细胞凋亡是脑缺血后脑损伤发生机制,Caspase-3蛋白参与了皮质静脉闭塞后脑缺血后神经元损伤的病理过程。