Ⅱ型肺泡上皮细胞间质转分化中的Notch-1/ Twist-1信号通路机制*

目的:通过研究Notch-1/Twist-1信号通路参与Ⅱ型肺泡上皮细胞间质转分化(EMT)作用,为阐明肺纤维化(PF)发病机制提供理论依据。方法:动物实验设对照组和博莱霉素(BLM)组(n=15)。气管注射BLM(7 500 U/kg)诱导肺纤维化大鼠模型,造模后28 d取左肺下叶固定于10%福尔马林中,进行HE、Masson及转化生长因子-β1(TGF-β1)免疫组化染色。体外培养Ⅱ型肺泡上皮细胞(RLE-6TN),细胞实验设对照(Control)组、TGF-β1(5 ng/ml)组、TGF-β1+ Notch-1 siRNA阴性对照组(NC siRNA, 100 pmol/L)和TGF-β1+Notch-1 siRNA干扰组(Notch-1 siRNA, 100 pmol/L),每组设9个复孔。细胞先用NC siRNA或Notch-1 siRNA预处理24 h,再用TGF-β1处理48 h。检测肺组织和(或)II型肺泡上皮细胞内TGF-β1、I型胶原(collagen I)、III型胶原(collagen III)、E-钙粘蛋白(E-Cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙粘蛋白(N-Cadherin)、Notch-1、Notch-1胞内域(NICD)、Hes-1和Twist-1 mRNA和(或)蛋白表达。结果:动物实验结果显示,与对照组相比,BLM组肺泡萎缩、塌陷并发生融合,肺泡间隔明显增宽,可见大量炎性细胞的浸润。肺间质胶原纤维沉积明显增多,collagen I和collagen III的表达明显增加(P＜0.01);另外,肺BLM组织中E-cadherin和ZO-1表达明显下降而Vimentin和N-cadherin的表达明显增加(P＜0.01);同时,BLM组肺组织TGF-β1、Notch-1、NICD、Hes-1和Twist-1的表达也明显上调(P＜ 0.01)。细胞实验结果显示,与Control相比,TGF-β1组Notch-1、NICD、Hes-1、Twist-1、collagen I和collagen III的表达明显升高,同时E-Cadherin和ZO-1的表达明显降低而Vimentin和N-cadherin的表达明显升高(P＜0.01)。与TGF-β1组相比,Notch-1 siRNA能够明显降低TGF-β1诱导Notch-1、NICD、Hes-1和Twist-1的表达(P＜0.05或P＜ 0.01),同时E-Cadherin和ZO-1的表达明显升高而Vimentin和N-cadherin的表达明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。另外Notch-1 siRNA还能够明显降低TGF-β1诱导的collagen I和collagen III的表达(P＜0.05或P＜0.01)。结论:Notch-1/Twist-1信号通路参与了Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT,可能参与了肺纤维化的发生发展。     

小剂量辣椒素抗小鼠肺纤维化的作用及其机制

目的: 观察小剂量辣椒素(Cap)抗小鼠肺纤维化的作用是否与其激动瞬时电位感受器香草酸受体1(TRPV1)有关。方法: 实验设对照(CON)组、博莱霉素(BLM)组、Cap(0.5、1、2 mg/kg)剂量组及Cap (2 mg/kg)+ TRPV1受体阻断剂SB-452533(2.5 mg/kg)剂量组,每组n=12。BLM(3.5 mg/kg)气管注射诱导肺纤维化小鼠模型。造模后连续皮下注射给药21 d。血浆降钙素基因相关肽(CGRP)浓度采用ELISA法快速测定。肺组织病理变化和胶原沉积分别采用HE染色、Masson染色和免疫组化进行检测。肺组织α-CGRP、β-CGRP、I 型胶原(collagen I)、III 型胶原(collagen III)、E钙粘蛋白(E-Cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TRPV1、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和真核翻译起始因子3a(eIF3a)mRNA及蛋白表达分别采用qPCR和(或)Western blot法检测。结果: 与BLM组相比,小剂量Cap给药21 d后,病理检查发现小鼠肺纤维化明显减轻;肺组织胶原表达明显下降(P＜0.05或P＜0.01);肺泡上皮细胞上皮间质转分化(EMT)明显受到抑制(E-Cadherin和ZO-1的表达明显升高(P＜0.05或P＜0.01)而Vimentin和α-SMA的表达明显降低(P＜0.05或P＜0.01));TRPV1和CGRP表达水平明显升高(P＜0.05或P＜0.01)而ERK磷酸化水平和eIF3a表达水平明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。但当使用TRPV1受体阻断剂阻断TRPV1后,小剂量Cap逆转肺泡EMT、改善肺纤维化的作用被显著取消,同时CGRP表达水平又明显降低(P＜0.01)而p-ERK1/2和eIF3a的表达水平又明显升高(P＜0.01)。结论: 小剂量Cap能够逆转肺泡上皮细胞EMT、缓解肺纤维化。其机制可能与其激动TRPV1、促进CGRP释放,进而抑制ERK磷酸化和下调eIF3a的表达有关。     

依帕司他对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的干预作用及其机制

目的:观察依帕司他(EPS)对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠间质纤维化的保护作用及其机制。方法:实验设假手术组(Sham)组、UUO、UUO+EPS(50 mg/kg)及UUO+EPS(100 mg/kg)剂量组,每组n=8。左侧输尿管结扎制备UUO大鼠模型。造模后连续灌胃给药3周,sham和UUO组给予等体积的羟甲基纤维素钠。HE和Masson染色观察肾组织病理变化及胶原沉积情况。免疫组化法观察肾组织醛糖还原酶(AR)表达情况,分别采用real-time PCR和(或) Western blot检测肾脏I型胶原(collagen I)、III型胶原(collagen III)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异蛋白-1(FSP-1)、纤连蛋白(FN)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、转化生成因子-β1(TGF-β1)和AR mRNA及蛋白表达。结果:与Sham组相比,UUO组大鼠小管上皮细胞萎缩、空泡样变性,肾间质成纤维细胞及肌成纤维细胞大量增殖并伴大量炎症细胞浸润,胶原沉积明显增加,collagen I、collagen III、TGF-β1和AR mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01),同时EMT标志性蛋白α-SMA、FSP-1、FN mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01),而E-cadherin mRNA及蛋白表达水平明显降低。与UUO组相比,经EPS治疗3周后,肾间质纤维化程度明显减轻,胶原沉积明显减少,collagen I、collagen III、TGF-β1和AR mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.01或P<0.05),另外α-SMA、FSP-1、FN mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.01或P<0.05),而E-cadherin mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01或P<0.05),而且100 mg/kg剂量组上述指标的改变均好于低剂量组(P<0.05,P<0.01)。结论:依帕司他对肾间质纤维化具有一定的改善作用,其机制可能与其抑制TGF-β1介导的AR表达、进而抑制大鼠肾小管上皮细胞EMT有关。