表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应

猪伪狂犬病毒（PRV）是一种良好的兽用活病毒疫苗载体。但以PRV基因缺失疫苗株TK^-/gE^-/LacZ⁺为载体表达PRRSV GP5的重组病毒TK^-/gE^-/GP5⁺免疫实验动物后难以激发抗PRRSV的中和抗体。为了进一步增强这种重组病毒的免疫效力,用具有更好免疫原性的修饰的ORF5基因（ORF5m）代替天然ORF5基因,构建了表达PRRSV的修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒TK^-/gE^-/GP5m⁺。经PCR、Southern blot、Western blot 证实构建正确,并能表达具有活性的GP5m蛋白。将TK^-/gE^-/GP5m⁺与TK^-/gE^-/GP5⁺分别免疫Balb/c小鼠,结果TK^-/gE^-/GP5m⁺免疫小鼠不仅产生了较高水平的抗PRRSV的中和抗体(3/6只达到了1∶16),而且在诱导PRRSV特异性细胞免疫方面也显著优于TK^-/gE^-/GP5⁺,表明TK^-/gE^-/GP5m⁺是一种极有希望的PRRSV和PRV二价基因工程候选疫苗。     

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5和M蛋白增强DNA疫苗免疫应答的研究

为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5基因)及ORF6为候选基因,构建了单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5m、pCI-ORF6及pCI-ORF5m/ORF6。转染BHK-21细胞,Western blot检测证实ORF5m和ORF6基因均获得正确表达,并且共表达的GP5m和M蛋白能够形成异源二聚体。将构建的表达质粒免疫小鼠,首免后6周共表达ORF5m和ORF6基因的pCI-ORF5m/ORF6免疫组小鼠血清中和抗体全部阳转,8周时最高可达到1:32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答,明显高于单独表达ORF5m基因的pCI-ORF5m免疫组。进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI-ORF5m/ORF6免疫组同样能诱发优于pCI-ORF5m免疫组的中和抗体和细胞免疫反应。上述研究结果表明采用ORF5m和ORF6双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA疫苗效力,为PRRSV新型疫苗的研制提供了有用的数据。     

牛疱疹病毒Ⅰ型VP22和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合基因DNA疫苗的免疫效应

为了提高表达GP5的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）DNA疫苗的免疫效应,将具有蛋白转导功能的牛疱疹病毒1型（BHV-1）VP22基因插入到经过修饰具有更好免疫原性的PRRSV修饰型ORF5基因（ORF5M）上游,构建VP22和ORF5M融合表达的真核表达质粒pCI-VP22-ORF5M。经间接免疫荧光试验（IFA）和Westernblot检测证实体外表达后,免疫BALB/c小鼠,检测小鼠免疫后的GP5特异性ELISA抗体、抗PRRSV中和抗体和脾淋巴细胞增殖反应,并与非融合的真核表达质粒pCI-ORF5M进行比较。结果显示,融合表达VP22-GP5的DNA疫苗 pCI-VP22ORF5M诱导的体液免疫和细胞免疫反应均明显高于非融合表达的DNA疫苗pCI-ORF5M,表明蛋白转导相关蛋白BHV-1 VP22能显著增强表达GP5的PRRSV DNA 疫苗的免疫效应,有效发挥了基因免疫佐剂效应;这为研制PRRSV高效DNA疫苗奠定了基础,同时也为其它疾病的高效新型疫苗研究提供了思路。     

与α疱疹病毒VP22蛋白融合增强“自杀性”DNA疫苗的免疫反应

α疱疹病毒VP22具有独特的蛋白转导特性,能通过一种不依赖于高尔基体的非经典途径从原始表达细胞转导到邻近的非表达细胞中,而且VP22还能使与之融合的外源蛋白在细胞间转导.因此,VP22是一种极具开发潜力的免疫增强分子.本研究以牛疱疹病毒1型(BHV- 1)的VP22为研究对象,以β-半乳糖苷酶（β-gal）为模式抗原,构建了BHV-1 VP22(BVP22)与β-gal融合的“自杀性"DNA疫苗表达质粒pSCAB-gal,转染BHK 21细胞.X-gal染色结果表明,表达的融合蛋白BVP22-gal仍具有蛋白转导能力,而单独表达β-gal的“自杀性"DNA疫苗表达质粒pSCA-gal不具有这种能力.进一步将pSCAB-gal和pSCA-gal分别免疫BALB/c小鼠,结果pSCAB-gal免疫能显著增强β-gal特异性ELISA抗体和细胞毒T细胞（CTL）活性,表明与BVP22融合能显著增强“自杀性”DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫反应.     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的构建及其生物学特性初步探讨

以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株TK/gG-/LacZ 为亲本株,通过同源重组,构建了表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病毒TK/gG-/GP5 .经PCR、Southern杂交、Western blot证实构建正确,并能表达GP5.同时,对重组病毒在PK-15细胞中的增殖特性进行了检测,结果与亲本株相比,增殖滴度无显著性差异.将重组病毒免疫BALB/c小鼠,2次免疫后4周,50%(3/6)小鼠产生了低水平的GP5特异性ELISA抗体,但中和抗体均小于1:4.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5-M在大肠杆菌中的融合表达及其ELISA诊断方法的建立

利用谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)表达系统将猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游 ,并在大肠杆菌中成功表达 ,获得了大小约为60kD的融合蛋白GST-GP5-M ,Westernblot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪繁殖与呼吸综合征P56-ELISA检测方法 ,与国外试剂盒IDEXX-ELISA总符合率为 94.1% ,表明建立的P56-ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。进一步分析了P56-ELISA检测结果与血清中和试验的相关性 ,经回归函数分析 ,发现在临床送检猪血清中的抗融合蛋白GP5 M抗体水平 (OD_630nm)与中和抗体水平之间的相关性并不高。     

融合表达牛疱疹病毒1型VP22及猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组伪狂犬病毒TK-/gE-/VP22GP5+的构建

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRRS)和伪狂犬病(pseudora-bies,PR)是两种严重危害养猪业的重要病毒性传染病。而引发PR的伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PRV)是构建基因工程疫苗优良的活病毒载体[1]。已有报道将表达猪瘟病毒(hog cholera virus,HCV)囊膜蛋白E1基因的重组PRV(rPRV)二价基因工程疫苗免疫猪后,能同时抵抗HCV和PRV的强毒攻击[2],显示了PRV作为活病毒载体的可行性和“一针防两病”的独特优点。由ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive …