胞嘧啶单碱基编辑技术与λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株的比较研究

由食源性致病菌引发的食品安全问题是威胁人类健康的重要因素。因此,研究食源性致病菌的感染机理对于控制病原菌危害具有重要意义。[目的] 以常见的食源性致病菌——鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,以其发挥重要致病性的转录调控因子SlyA为靶标,比较胞嘧啶单碱基编辑技术（CRISPR/Cas9-guided-Cytidine Base Editor,CBE）和λ-Red同源重组技术在构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株方面的方法差异,为鼠伤寒沙门氏菌的基因编辑技术应用提供数据。同时,也为其他类型病原菌的基因编辑技术开发提供有力参考。[方法] 采用PCR、Golden Gate、Sanger测序等方法完成CBE系统以及λ-Red系统的构建以及敲除结果的验证,采用Editor-R软件分析CBE系统的单碱基编辑效率,采用Western blotting在蛋白表达层面对敲除结果进行验证。此外,本研究还结合了表型鉴定的方法验证了基因敲除结果。[结果] 经PCR产物测序鉴定、Western blotting分析及溶血素活性鉴定等结果表明,本研究成功将CBE系统应用于鼠伤寒沙门氏菌slyA的单碱基编辑中,应用前述两种方法构建了鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株。[结论] CBE系统虽然以其操作的简便性在基因编辑中优势明显,但同λ-Red系统相比,该方法需要设立特定的gRNA及PAM位点,在非模式菌株中的普适性较低,且在进行编辑时,CBE系统存在不稳定的问题。尽管如此,但CBE系统在鼠伤寒沙门氏菌中的成功建立,为进一步拓展与完善该菌的基因编辑系统提供了基础。     

酵母甾醇转运蛋白研究进展

甾醇是一类广泛存在于生物体内的环戊烷骈多氢菲衍生物,其不仅是细胞膜的重要组成成分,还具有重要的生理和药理活性。随着合成生物学和代谢工程技术的发展,近些年来应用酵母细胞异源合成甾醇的研究不断深入。但由于甾醇是疏水性大分子,倾向于积累在酵母的膜结构中而引发细胞毒性,一定程度上限制了甾醇产量的进一步提升。因此,揭示酵母中甾醇转运机制,特别是与甾醇转运相关的转运蛋白的工作原理,有助于设计新的策略,解除酵母细胞工厂中的甾醇积累毒性、实现甾醇增产。酵母中甾醇转运主要通过蛋白质介导的非囊泡运输机制来完成,本文归纳了酵母中已报道的5类甾醇转运相关蛋白,即OSBP/ORPs家族蛋白、LAM家族蛋白、NPC样甾醇转运蛋白、ABC转运家族蛋白和CAP超家族蛋白,汇总了这些蛋白对细胞内甾醇梯度分布和稳态维持所起的重要作用。此外,本文还综述了甾醇转运蛋白在酵母细胞工厂中的应用现状。     

细胞膜合成途径模块化调控与形态改造提高大肠杆菌β-胡萝卜素的积累与产量

β-胡萝卜素是类胡萝卜素家族中的典型代表,属于疏水性较强的化合物,前期研究表明,改变细胞膜形态以及增加3-磷酸甘油二酯的供给,均可容纳更多的β-胡萝卜素,从而提高其产量。然而在之前的研究中,没有对细胞膜的磷脂中主要组分磷脂酰乙醇胺的合成途径对β-胡萝卜素积累的影响进行系统的讨论。本研究将磷脂酰乙醇胺的合成途径分为上中下游3个模块,对它们的多种表达组合策略进行比较。首先过表达了上游模块1,菌株CAR016的β-胡萝卜素的产量与单位细胞的β-胡萝卜素产量均有显著提高,分别可达到44 mg/L以及13.7 mg/g DCW。与对照菌株相比,分别提高30.5%与35.6%。过表达磷脂酰乙醇胺合成的中游模块,β-胡萝卜素的产量以及单位细胞的β-胡萝卜素的产量分别为103.5 mg/L DCW与19.8 mg/g DCW。与对照菌株CAR016(pACYC184-M)相比,分别提高1.4倍与53.5%。将上游模块1与中游模块2共表达,菌株CAR016(pModule1,pModule2)单位细胞的β-胡萝卜素产量为22.3 mg/g DCW。与CAR016(pModule2)相比,单位细胞产量提高18%,与出发菌株CAR016(pTrc99A-M,pACYC184-M)相比,单位细胞的β-胡萝卜素产量提高122%。本研究找到了磷脂酰乙醇胺合成途径表达的最优组合策略,可以产生更大量的细胞膜,为储存β-胡萝卜素提供了更多的空间,从而进一步提高β-胡萝卜素的产量。细胞膜形态和合成途径的模块化改造,是今后提高类胡萝卜素产量的新方向。