花椰菜ACC氧化酶基因的克隆及其RNAi对内源基因表达的抑制作用

根据亲缘关系较近的几种作物ACC氧化酶氨基酸序列,设计一对简并引物,从花椰菜(Brassica oleracea var．botrytis)基因组中获得长1202bp的候选片段。序列分析表明该基因含有3个外显子(Exon)、2个内含子(Intron),编码区序列长756bp,编码252个氨基酸。同源性分析发现其与青花菜(Brassica oleracea var．Italica)上已发表mRNA序列同源率为99％(GenBank序列号：X81629),推断该基因为花椰菜ACC氧化酶基因,命名为BoACO(GenBank登录号：AY676466)。在此基础上,用BP克隆的方法构建BoACO的RNA干涉(RNAi)载体pHBACO,对花椰菜进行遗传转化,获得卡那霉素抗性转化植株5棵,分子检测证实外源片段成功导入其中3棵花椰菜基因组中。Northern杂交分析显示：转基因植株内源ACO基因转录的mRNA被降解。ACC氧化酶活性分析进一步表明,外源基因的导人大大地降低了ACC氧化酶活性。     

番茄两个盐胁迫响应基因的cDNA克隆及其表达分析

根据前期耐盐芯片研究提供的两条EST序列设计引物,利用RACE技术从番茄耐盐品种Edkawi中克隆了其5’和3’片段,并拼接成全长cDNA,分别命名为SISRGl和SISRG2。两个基因序列在GenBank中的登录号为EU670751和EU670752,其大小分别为1300bp和1810bp,编码蛋白分别为309和499个氨基酸。半定量RT,PCR表明SISRGl在番茄茎、叶、花中表达较强,在所检测的其它组织中表达很弱,SISRG2在叶和花中表达量最高,其次为茎和根,在果实中表达微弱。盐胁迫表达谱结果显示SISRGl在盐处理的Edkawi中缓慢增强,SISRG2则在盐胁迫后表达迅速增强,在未进行盐胁迫的对照中,两个基因的表达趋势均为减弱。本研究为番茄抗逆研究提供了新的候选基因资源。     

番茄GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶cDNA的克隆、表达及定位

GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶催化GDP-D-甘露糖的合成,是植物抗坏血酸生物合成途径中上游的关键酶。以马铃薯GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶cDNA序列为信息探针,在GenBank dbEST数据库中找到65条高度同源的番茄EST序列,通过序列拼接及RACE-PCR得到了番茄该基因的全长cDNA序列,命名为LeGMP。LeGMP与马铃薯GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶cDNA序列一致率为96％,推导的氨基酸序列与马铃薯、烟草、紫苜蓿、拟南芥的GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因的一致率分别为99％、97％、91％、89％。经Northern杂交分析,LeGMP在番茄根、茎、叶、花、果实中都有表达,但表达水平有差异。利用75个番茄远缘杂交重组系（IL系）将LeGMP定位在番茄第3染色体上的D区段（3-D）。     

利用转基因标记NPTⅡ快速、规模化纯合转基因番茄

利用卡那霉素喷施方法对带有NPTⅡ标记基因和双价外源基因(烟草渗调蛋白基因AP24和菜豆几丁质酶基因Chi)的转基因番茄的3个世代在温室或田间环境进行规模化筛选,成功获得8个单拷贝转基因纯合植株。含有单个拷贝NPTⅡ标记基因的转基因株系后代,对卡那霉素的抗感分离符合3:1的孟德尔分离比例,T₂代中一些株系表现为对卡那霉素全抗,表明这些株系的外源基因已经纯合,这一结果在T₃代中进一步得到证实。但对于含有两个拷贝外源基因的转基因株系,外源基因的遗传则比较复杂。同时,结合Km喷施和多重PCR技术对外源基因的异常遗传进行了初步分析。用PCR分析进一步证实了该方法的准确性,该方法是对转基因番茄进行大规模、快速遗传分析的理想方法。     

番茄低温响应转录因子SlNAC41克隆及表达分析

NAC转录因子在调控植物生长发育、生物及非生物逆境应答中发挥着重要作用。前期,我们通过对番茄幼苗在低温胁迫下的基因表达谱进行分析,发现Unigene SGN-U212711受低温诱导表达强烈。本研究从番茄中克隆了该基因,命名为Sl NAC41,其开放阅读框（ORF）1 173 bp,编码390个氨基酸,蛋白N端具有典型的NAM结构域,属于NAC转录因子家族成员。预测Sl NAC41蛋白分子量为43.5 k Da,等电点为5.2。实时荧光定量PCR分析表明,Sl NAC41在番茄各组织均有表达,在花中的表达量最高,在红熟果中的表达量最低。低温、干旱、高盐、甲基紫精（MV）、脱落酸（ABA）及乙烯利（ETH）处理均能诱导该基因的表达,其中,以低温和干旱诱导表达最为强烈。利用PLACE和Plant CARE对启动子序列进行预测分析发现,Sl NAC41启动子区含有大量响应光、病原菌侵染、激素、低温、脱水及盐胁迫的顺式作用元件。这些结果表明,Sl NAC41可能在番茄生物及非生物胁迫应答中发挥重要调控作用。     

植物β-1,3-葡聚糖酶及其基因

β 1 ,3 葡聚糖酶属PR 2类蛋白 ,能催化真菌细胞壁的重要成分-β 1 ,3 葡聚糖和 β 1 ,3 1 ,6 葡聚糖的水解 ,水解的寡糖产物是植物防御反应的重要激发子。β 1 ,3 葡聚糖酶在植物抵抗真菌病害中发挥着不可忽视的作用 ,关于 β 1 ,3 葡聚糖酶特别是其作用机制和基因表达调控的研究取得了突出进展。β 1 ,3 葡聚糖酶基因和其它抗病相关基因的综合利用将成为植物抗真菌基因工程的有效途径。     

利用转基因标记NPTⅡ快速、规模化纯合转基因番茄

利用卡那霉素喷施方法对带有NPTⅡ标记基因和双价外源基因(烟草渗调蛋白基因AP24和菜豆几丁质酶基因Chi)的转基因番茄的3个世代在温室或田间环境进行规模化筛选,成功获得8个单拷贝转基因纯合植株。含有单个拷贝NPTⅡ标记基因的转基因株系后代,对卡那霉素的抗感分离符合3∶1的孟德尔分离比例,T2代中一些株系表现为对卡那霉素全抗,表明这些株系的外源基因已经纯合,这一结果在T3代中进一步得到证实。但对于含有两个拷贝外源基因的转基因株系,外源基因的遗传则比较复杂。同时,结合Km喷施和多重PCR技术对外源基因的异常遗传进行了初步分析。用PCR分析进一步证实了该方法的准确性,该方法是对转基因番茄进行大规模、快速遗传分析的理想方法。     

玉米素和IAA对番茄子叶再生的影响

高水平的外源ZT抑制番茄子叶不定芽形成,导致畸形芽大量出现,延缓再生芽的生根过程。在低水平的ZT和高浓度的IAA共同作用下,不定芽的再生速度加快,正常芽比例增加,后期生根过程明显加快。     

转双价水解酶基因番茄植株对枯萎病抗性的提高

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,首次将莱豆几丁质酶和烟草β-1,3-葡聚糖酶双价水解酶基因导入番茄品种A53(Lycopersicon esculentum cv.A53)中,获得批量转基因再生植株。对外源基因的PCR和Southern杂交结果表明,外源基因已经整合到番茄基因组中,其拷贝数1-8个不等。Northern杂交和卡那霉素喷施表明目的基因和标记基因均已得到表达,抗病性鉴定初步表明转基因植株对枯萎病的抗性显著提高。