花生防御素基因的克隆及原核表达

定基础.     

花生种皮蜡质和角质层与黄曲霉侵染和产毒的关系

黄曲霉侵染花生的研究表明,种皮破损的黄曲霉毒素含量显著高于种皮完整的,种皮对黄曲霉侵染和产毒起着重要屏障作用。采用氯仿去除种皮蜡质,用KOH或角质酶去除种皮角质层后,种子黄曲霉感染率和黄曲霉毒素含量显著提高。种皮蜡质和角质层同时去除的与种皮破损的黄曲霉感染率和毒素含量差异不显著,表明种皮的抗性成份主要是蜡质和角质层。种皮蜡质含量测定和种皮表面扫描电镜观察表明,蜡质的含量和角质层的厚度与品种的抗性有关。抗性品种种皮蜡质含量显著高于感病品种。种皮蜡质提取物在体外抑菌效果不显著。说明蜡质的抗性作用主要是物理性阻止黄曲霉菌的穿透。     

沙田柚黄龙病病原体的电镜观察与PCR检测

柑桔黄龙病可以侵染沙田柚而产生典型的‘斑驳’症状。我们通过电镜观察表明,带病沙田柚的病原体在形态,大小和构造上均与柑桔黄龙病病原体（类细菌）相似：PCR扩增也证明其病原体DNA与柑桔黄龙病病原体的PCR产物具有很高的同源性。     

花生ARAhPR10基因启动子序列的克隆及分析

PR10(pathogenesis-related class10protein)类蛋白与植物的抵御外来病害及系统获得性抗性(SAR)有着紧密联系,本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗黄曲霉花生品种粤油20中克隆ARAhPR10(Aspergillus flavus-resistant AhPR10)基因起始密码子ATG上游256bp类似启动子序列,并对其进行植物顺式作用元件数据库PLACE预测分析。结果表明,该类似启动子序列含有4处TATA box和2处CAAT box保守的启动子结构元件,还有6处W-box、1处BIHD1和3处GT-1motif抗逆应答元件,其中W-box常见于PR蛋白的启动子区内参与病程应答。我们初步认为本研究克隆的序列可能是ARAhPR10基因的启动子。     

绿色木霉TvALP-linker-TvRBL融合基因的构建与原核表达

在Tv ALP基因和Tv RBL基因间加入一段柔性链接头(linker)基因序列,构建融合基因。生物信息学分析表明该融合基因含有一段信号肽序列。利用RT-PCR技术从绿色木霉菌丝体总RNA中扩增出Tv RBL基因、Tv ALP基因和去除信号肽的ΔTvALP基因,分别克隆到原核表达载体p ET30a,构建重组质粒p ET30a-Tv ALP-linker-Tv RBL和p ET30a-ΔTv ALP-linker-Tv RBL,转化大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明,去除信号肽的表达质粒p ET30a-ΔTv ALP-linker-Tv RBL在大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S中获得了表达,在60 k D处有一条蛋白质特异条带,与预测的目的产物蛋白条带大小一致。     

花生抗黄曲霉相关ARAhPR10基因克隆及其原核表达

花生黄曲霉污染已成为制约我国花生及花生制品出口贸易的关键因素.基于花生抗黄曲霉相关EST序列,RT-PCR法克隆花生ARAhPR10基因(gb|EU661964.1),开放读码框471 bp,编码157个氨基酸,分子量16.9 kD,等电点5.03.与已报导AhPR10(gb|AY726607)相似性为49.3%.推导氨基酸序列含有PR10家族的高度保守"P-loop"基序(G*GG*G)和Betv1保守疏水结构域"GVALP PTAEK ITFET KLVEG PNGGSIGKLT LKY",推测ARAhPR10是该花生PR10家族的新成员.其基因组扩增序列长度561 bp,两个外显子间存在一个长度为87 bp的内含子.原核表达ARAhPR10的融合蛋白约25 kD,Ni+-NTA树脂亲和纯化后获得电泳单一条带.纯化的ARAhPR10融合蛋白具有体外核酸酶活性,预测其具有抗黄曲霉活性.该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为ARAhPR10功能研究奠定了基础.