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为创制棉花耐旱种质资源，解决棉花耐旱资源贫乏以及提高水资源利用率，研究依据CRISPR/Cas9编辑原理，对课题组前期利用RT-PCR技术筛选耐旱相关基因GhNAC3(Gh＿D02G0790)的第一外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点，并在陆地棉基因组数据库中比对分析靶点序列，排除非特异性编辑，将2个靶点核苷酸片段分别与gRNA-AtU6载体连接，通过2次PCR扩增，得到含特异性连接接头的AtU6-GhNAC3表达盒，再将表达盒连接到CRISPR/Cas9(pRGEB32-7)载体上，获得CRISPR-GhNAC3重组表达载体，利用农杆菌介导法转化陆地棉受体YZ-1,再生培养得到T0代转基因幼苗，通过PCR检测Cas9蛋白基因获得阳性株系。对T0代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析，鉴定GhNAC3编辑类型。结果发现，CRISPR9-GhNAC3表达载体成功转化YZ-1,并获得40株转基因再生植株，经Cas9蛋白基因鉴定得到30株阳性株系，从阳性植株选择10株进行编辑类型测序分析，发现7株在靶点区域发生编辑，编辑类型主要为碱基片段缺... 相似文献
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