施氏假单胞菌氮代谢调控蛋白GlnK与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作研究

细菌中PⅡ蛋白是一类氮代谢调控因子,可通过感知胞内碳氮信号变化调整自身与靶蛋白的相互作用,从而实现对下游基因的级联调控。α-酮戊二酸是胞内碳状态的重要信号分子,前期研究发现PⅡ蛋白可结合α-酮戊二酸感应细胞内的碳状态,但不同菌中二者的结合存在差异。施氏假单胞菌A1501（Pseudomononas stutzeri A1501）只含有1种PⅡ蛋白GlnK,其在A1501固氮调控中发挥重要作用,但具体碳信号感知与转导机制有待进一步探索。基于此,通过大肠杆菌外源表达GlnK蛋白,并通过微量热泳动（microscale thermophoresis,MST）方法研究GlnK蛋白与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作,发现二者可以体外结合,且进一步证实GlnK蛋白的第89位甘氨酸（G89,Gly89）可能与互作相关。研究结果为进一步解析α-酮戊二酸在A1501中的信号转导奠定了基础,也为深入解析固氮菌的碳氮代谢偶联机制提供了理论支持。     

施氏假单胞菌A1501铁吸收调节蛋白Fur的表达特性与功能鉴定

铁是细胞生理代谢的重要金属元素,是多种氧化还原酶类、过氧化物酶类的重要组成部分。革兰氏阴性菌中,胞内铁转运、储存和利用主要由铁吸收调节蛋白Fur（ferric uptake regulator）调控。水稻根际联合固氮菌——施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501基因组中含有一个fur同源基因,但其具体功能尚不清楚。比较了A1501中fur基因及其编码蛋白的序列特征,并通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative,qRT-PCR）和Western blotting杂交方法测定了fur基因和Fur蛋白的表达特性,结果发现fur基因表达水平与环境中铁浓度呈负相关,在铁限制条件下高表达,铁过量条件下表达受抑制。构建了fur基因突变株和功能回补株,表型测定发现fur突变影响了A1501的碳源代谢谱,并导致A1501对过氧化氢胁迫敏感。胞内铁含量测定表明,fur突变株内的铁含量为野生型的1.3倍,进一步qRT-PCR测定表明fur突变影响了铁离子转运系统及过氧化物酶编码基因的表达。研究结果为解析根际微生物胞内铁平衡调节及根际环境适应机制奠定了理论基础。