HPV16 E6对HeLa细胞中Rap1GAP蛋白水平下调的研究

目的探讨HPV16E6对细胞中Rap1GAP蛋白水平的影响,为阐明宫颈癌发生发展的分子机制提供实验依据。本研究组前期实验显示,宫颈癌石蜡切片组织中Rap1GAP蛋白水平下降,且与高危型HPV16/18感染相关。本文将进一步探讨HPV16 E6是否导致Rap1GAP蛋白下调的原因。方法通过将HPV16 E6基因插入pGEX-KG的BamHI和Hind Ⅲ酶切位点构建GST标记的HPVE6质粒,采用脂质体转染法将其转染入HeLa细胞中,Westernblot方法观察GST-tagged-HPV16 E6在HeLa细胞中的表达,并观察其对HeLa细胞中内源性Rap1GAP蛋白水平的影响。结果测序表明成功构建GST标记的HPV16E6质粒;Western blot检测表明HPV16E6在HeLa细胞中成功表达;并且发现HeLa细胞中过表达HPV16 E6后,Rap1GAP蛋白相对含量(0.602±0.205)明显低于未转染组(1.130±0.163),差异具有统计学意义(P0.05)。结论HPV16 E6下调Rap1GAP蛋白水平。     

两种荧光探针标记鹿茸提取物的稳定性和生物活性比较研究

比较两种荧光探针异硫氰酸荧光素FITC和Cy5标记鹿茸提取物PAEs的最佳方法。用FITC和Cy5分别标记PAEs得到标记物FITC-PAEs和Cy5-PAEs;用SDS-PAGE凝胶电泳检测并比较两种荧光染料标记蛋白分子量的差异;用酶标仪检测在特定波长处OD值计算其标记率;用PC12细胞验证两种荧光染料的生物安全性;将荧光标记物分别与人工胃液和人工肠液共孵育,观察它们在其中的稳定性。结果表明,两种荧光染料标记PAEs蛋白分子量并无明显差异,但FITC-PAEs荧光强度稍强。通过计算标记率表明两种荧光染料均可充分标记PAEs,但Cy5价格昂贵。相比于FITC-PAEs,Cy5-PAEs在人工胃液和人工肠液中稳定性较差。因此,我们选择标记率高,在人工胃液和人工肠液中较为稳定且对机体无毒副作用,价格合理的FITC荧光染料标记PAEs并用于后续实验研究。这为建立蛋白类中药大分子的活性示踪方法,开发口服蛋白类药物奠定基础。     

二次谐波结合双光子荧光成像方法观察人源胶原蛋白透皮吸收情况

目的:用二次谐波成像结合双光子荧光成像的方法观察人源胶原蛋白透皮吸收的情况。方法:将荧光标记的人源胶原蛋白(1 mg/mL)涂抹于小鼠表皮层经皮肤吸收1 h后用背向二次谐波观察皮肤内胶原纤维作为真皮层定位标志,用双光子扫描共聚焦显微镜观察人源胶原蛋白透皮吸收深度,吸收方式。结果:二次谐波成像结合双光子荧光成像表明人源胶原蛋白透皮吸收1 h后可观察到荧光信号沿着毛囊聚集,并有部分荧光分子由毛囊扩散至真皮层。结论:二次谐波可以更快速,更灵敏地检测皮肤中的胶原纤维,以此作为检测物质透皮吸收深度的定位标志,具有不受荧光信号干扰的优点。人源胶原蛋白可以沿着毛囊进入真皮层,并从毛囊中扩散至胶原纤维层从而补充皮肤中的胶原纤维。