脂联素基因剔除小鼠糖代谢和骨代谢的初步研究

目的:研究前期建立的脂联素基因剔除小鼠模型在基础状态的葡萄糖代谢及骨代谢状态。方法:采用长期追踪野生型和该基因剔除纯合子小鼠的体重和空腹血糖水平,并进行葡萄糖耐量(GTT)和胰岛素耐量(ITT)试验以评价该小鼠的葡萄糖代谢能力。对骨代谢的初步研究采用检测小鼠骨密度(BMD)的方式。结果:发现该基因剔除小鼠在6w时,出现空腹血糖比对照组显著低下的现象,而随着鼠龄的增长,血糖水平又趋于正常。GTT和ITT试验证明该基因剔除小鼠无糖尿病或胰岛素抵抗表型。BMD检测亦显示该小鼠在基础状态下无骨密度低下的现象。结论:脂联素基因剔除小鼠在基础状态下并无显著的糖代谢和骨代谢异常。     

Adiponectin 基因剔除LacZ基因敲入小鼠模型的建立

adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件.     

骨保护素(Opg)基因敲除小鼠发生高转换型骨质疏松和动脉钙化

骨质疏松以及动脉钙化均是危害极大的临床常见病变,骨保护素(OPG)可能是联系两者的分子之一.构建替换型载体pXpPNT-OPG,利用同源重组,将编码前3个蛋白质结构域的小鼠Opg基因组第二外显子序列剔除掉.通过胚胎干细胞(ES)基因打靶获得了正确重组的ES细胞克隆,ES细胞显微注射后获得嵌合体小鼠,交配传代获得杂合子和纯合子小鼠.RT-PCR和蛋白质印迹实验结果显示,纯合子小鼠没有Opg基因的表达.纯合子小鼠骨量丢失明显,骨生物力学指标明显下降,发生严重的骨质疏松,此外,还有50%以上的纯合子小鼠在早期出现动脉中层钙化.小鼠破骨功能亢进,与此同时,成熟成骨细胞数量增加,矿化功能强于野生型.Opg基因缺失小鼠骨中钙和磷大量流失,而血清中水平没有变化,这提示钙磷代谢异常不是OPG缺失导致动脉钙化的原因.对建立的Opg基因敲除小鼠模型进一步深入的研究,将有助于说明动脉钙化和骨质疏松症相互联系的分子机制,为防治骨质疏松症和动脉钙化的并发提供理论基础支持.     

免疫荧光法检测氧诱导小鼠视网膜的病变

目的:观察氧诱导小鼠视网膜的病变情况.方法:出生7d的129Sv/C57BL6J小鼠随机分为实验组和对照组,各28只.实验组置(75 2)%高氧环境、室温(23:1:2)℃,日光照明,5d后返回空气环境;对照组置(23±2)℃空气环境中饲养.出生后第17d在视网膜平铺片及冰切片上通过免疫荧光法定量检测视网膜血管的增生情况,比较两组星型胶质细胞、小胶质细胞的差异,并通过TUNEL法检测细胞凋亡的情况.结果:出生后第17d实验组视网膜出现无血管区域,新生血管计数高于对照组(P<0.01);星型胶质细胞增多、密集,与相邻的血管间的联系紧密,其小胶质细胞出现活化和增殖,突起少而短,并有胞体肿胀现象;实验组小鼠视网膜存在细胞凋亡.结论:(75 2)%高氧环境、室温(23±2)℃成功诱导小鼠视网膜的病变.     

骨保护素(Opg)基因敲除小鼠发生高转换型骨质疏松和动脉钙化

骨质疏松以及动脉钙化均是危害极大的临床常见病变，骨保护素 (OPG) 可能是联系两者的分子之一. 构建替换型载体pXpPNT-OPG，利用同源重组，将编码前3个蛋白质结构域的小鼠Opg基因组第二外显子序列剔除掉. 通过胚胎干细胞 (ES) 基因打靶获得了正确重组的ES细胞克隆，ES细胞显微注射后获得嵌合体小鼠，交配传代获得杂合子和纯合子小鼠. RT-PCR和蛋白质印迹实验结果显示，纯合子小鼠没有Opg基因的表达. 纯合子小鼠骨量丢失明显，骨生物力学指标明显下降，发生严重的骨质疏松，此外，还有50%以上的纯合子小鼠在早期出现动脉中层钙化. 小鼠破骨功能亢进，与此同时，成熟成骨细胞数量增加，矿化功能强于野生型. Opg基因缺失小鼠骨中钙和磷大量流失，而血清中水平没有变化，这提示钙磷代谢异常不是OPG缺失导致动脉钙化的原因. 对建立的Opg基因敲除小鼠模型进一步深入的研究，将有助于说明动脉钙化和骨质疏松症相互联系的分子机制，为防治骨质疏松症和动脉钙化的并发提供理论基础支持.