巴西固氮螺菌中P_Ⅱ和P_Z在固氮调节中的不同作用

在巴西固氮螺菌 (Azospirillumbrasilense)中 ,glnB和glnZ是两个高度同源基因 ,分别位于 3 7kb EcoRI+PstI和 3 7kb SalI的两个不同的染色体片段上。用卡那霉素盒 (Kmr cas sette)插入法 ,对glnB和glnZ分别进行定位诱变 ,并获得相应的突变株 ,即glnB- 和glnZ- 。研究表明 ,glnB- 突变株丧失固氮酶活性 ,表现为Nif- ,而glnZ- 象野生型菌株一样具有固氮酶活性。为了进一步研究这两个基因的功能 ,将glnB和glnZ分别构建在pVK1 0 0载体上形成重组质粒pVK -Ⅱ和pVK -Z ,对glnB- 和glnZ- 突变株进行互补实验 ,进一步证明了glnB与固氮酶活有直接相关性 ,而glnZ无此作用。同时 ,通过三亲接合法将pVK -Ⅱ和pVK -Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT- 突变株中 ,使glnB和glnZ的拷贝数增加 ,进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的glnB基因 ,能显著提高固氮酶活性 ,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响。同时 ,将pVK Ⅱ和pVK -…     

巴西固氮螺菌Yu62glnB基因的克隆及其功能分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌Yu62的基因文库中,筛选到glnB基因的阳性克隆,将3.7kb/EcoRI PstI的阳性克隆亚克隆到pUC19中,进行了全序列分析,其在GenBank中的登记号是AF323960。DNA序列分析表明该阳性克隆含有完整的glnB基因,glnB基因下游是编码谷氨酰胺合成酶（GS）的glnA基因,glnB基因上游是一个编码未知蛋白的ORF。glnB基因编码区长336bp,编码112个氨基酸,与肺炎克氏杆菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大肠杆菌在氨基酸顺序的同源性分别高达71%、77%、79%和69%。将卡那霉素抗性片段（Km-cassette)插入glnB基因的BglII位点,通过三亲杂交法将其引入到巴西固氮螺菌Yu62中,通过同源重组,获得GlnB^-突变株（glnB::Km）。为进一步分析glnB基因的功能,将glnB基因的编码区（339bp）构建在pVK100中,置于Km启动子下组成型表达,形成重组质粒pVK-II。将重组质粒pVK-II转入到GlnB^-突变株,构建成互补株C-glnB(glnB:Km/glnB)。对GlnB^-突变株和互补株的固氮酶活性和生长性能的测定表明,GlnB^-突变体无固氮酶活性,即表型为Nif^-;而互补株像野生型菌株一样具有固氮酶活性。突变株、互补株及野生型在菌落生长速度上基本相同。将含有glnB基因的重组质粒pVK-II分别转移到野生型Yu62菌株和具有一定抗铵能力的DraT^-突变标中,使glnB基因的拷贝数增加,并进一步比较它们的固氮酶活性,结果表明多拷贝的glnB基因能显著提高固氮酶活性。