M2型丙酮酸激酶与肿瘤自噬

M2型丙酮酸激酶(M2 isoform pyruvate kinase, PKM2)是糖酵解途径的关键酶。PKM2在多种肿瘤中高表达,且与肿瘤发生发展密切相关。自噬(autophagy)是一个溶酶体依赖的胞内降解过程。自噬通过对肿瘤细胞葡萄糖摄取、糖酵解途径进行调控,从而影响肿瘤的生物学行为。近年来的研究逐步揭示,PKM2与肿瘤自噬之间可相互调控,PKM2可影响肿瘤自噬的发生和结果,自噬可影响PKM2的活性和蛋白量,且二者的相互作用与病人总体生存率密切相关。这些发现将为针对PKM2及自噬的肿瘤临床治疗带来新的思路。     

G6PD缺陷抑制人黑色素瘤细胞裸鼠移植瘤的生长

敲减葡糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)表达的人黑色素瘤A375细胞(A375-G6PDΔ) 呈现生长增殖抑制和凋亡率升高. 为明确G6PD缺陷对裸鼠体内成瘤的影响及其可能机制,用A375-WT与A375-G6PDΔ细胞制作裸鼠荷瘤模型,观察体内瘤体生长,real-time PCR、免疫组织化学染色与紫外分光光度法分别检测瘤体组织G6PD mRNA、G6PD蛋白及酶活性,Western 印迹分析凋亡相关蛋白,分光光度法测定NADPH和GSH/GSSG水平. 结果显示,A375-G6PDΔ细胞注射组的裸鼠成瘤时间延长,瘤体生长明显减慢,瘤体的体积与质量显著低于A375 WT细胞注射组（P <0.01）;与A375-WT细胞注射组相比,A375 G6PDΔ细胞注射组的裸鼠瘤体组织中G6PD mRNA表达、G6PD阳性细胞数与G6PD活性分别降低了87.10%、77.20%与75.77%（P<0.01）,G6PD、p53和Bcl-2的表达分别降低了67.92%、65.54%和62.32%（P<0.01）,Fas升高了86.38%（P<0.01）,NADPH和GSH/GSSG分别降低了74.37%和86.02%（P<0.01）. 结果提示,G6PD缺陷可能通过减少核酸等合成的原料、改变细胞内氧化还原状态及凋亡相关蛋白表达抑制裸鼠瘤体生长与增殖,这为黑色素瘤发生和治疗研究提供了新的线索.     

异常激活的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶通过上调周期蛋白D1表达促进肾透明细胞癌增殖

葡萄糖6-磷酸脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD）为磷酸戊糖途径的调节酶。研究表明,G6PD与多种恶性肿瘤的发生密切相关。然而,G6PD在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）中的功能及其作用机制却鲜有报道。本研究通过TCGA数据分析发现,G6PD在肾透明细胞癌TNM Ⅲ/Ⅳ期mRNA表达水平显著升高,与患者的性别、原发肿瘤直径、淋巴结转移、远端转移、病灶一侧的偏重性、病理分级以及TNM临床分期密切相关。并且,G6PD异常激活有可能成为评价肾透明细胞癌患者不良预后的分子。细胞系检测结果提示,与对照293T细胞及恶性程度较低的786-O细胞相比,恶性程度较高的Caki-1细胞中的G6PD表达及活性明显增加。基因稳定转染结合CCK8分析结果显示,G6PD过表达或异常激活可显著提高293T及786-O细胞的增殖能力,并且促进786-O细胞中周期蛋白D1基因表达上调。综上,本研究通过TCGA数据库分析和稳定细胞系检测及CCK8分析,结果显示,G6PD在肾透明细胞癌中异常激活,并可上调细胞周期蛋白D1表达,进而促进肿瘤细胞增殖。该研究为进一步揭示肾透明细胞癌分子发病机制以及开发有效的靶向治疗方案提供了借鉴。     

G6PD通过细胞周期蛋白D1/D2调控人黑色素瘤细胞周期的进程

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在人皮肤黑色素瘤A375细胞中处于高表达与高活性状态, 但G6PD在黑色素瘤发生发展过程中的作用及其具体机制尚不明确.本文在前期运用 siRNA方法构建G6PD敲减的黑色素瘤A375稳转细胞(A375-G6PDΔ)基础上,构建表达载体pBabe-puro-G6PDWT在A375-G6PDΔ细胞中过表达野生型的G6PD基因,从而构建G6PD表达恢复的稳转细胞(A375-G6PDΔ-G6PDWT).3株细胞A375-WT、A375-G6PDΔ和 A375-G6PDΔ-G6PDWT经G6PD酶活性测定、MTT测定、克隆形成实验、流式细胞仪分析细胞周期和Western 印迹检测.结果显示,A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞的G6PD蛋白表达量 (0.847 ± 0.080)及其活性(0.394 ± 0.029)分别是A375-G6PDΔ的3.28倍(P＜0.01) 和7.34倍(P＜0.01),分别是A375-WT细胞的91-57%和2.12倍(P＜0.05).与A375-WT细 胞相比,A375-G6PDΔ细胞G0/G1期细胞数增加,S期细胞数减少,增殖指数PI降低了25-70%（P＜0.05）,细胞周期蛋白D1/D2、细胞周期蛋白E表达分别下降37.4%、54.3% (P＜0.01)和17.3%;而A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞呈现G1/S期阻滞解除,细胞周期蛋白D1/D2蛋白分别恢复到A375-WT细胞的89.5%和87.6%,细胞周期蛋白E表达未见 恢复,呈现生长增殖和克隆形成率的恢复并接近于A375-WT细胞. 结果提示,G6PD通 过细胞周期蛋白D1/D2调控人皮肤黑色素瘤A375细胞G1期向S期转换的进程,这为黑色 素瘤发病机制的研究提供了新的思路.     

中国西南阿昌族G6PD缺陷的特征及新单体型487G>A/IVS5-612(G>C)的鉴定

探讨中国西南部疟疾高发区云南省梁河县阿昌族人群的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷的发生率及其分子特征. 四氮唑蓝纸片法和G6PD/6PGD活性测定筛查490阿昌族个体 (男260人, 女230人), 发现男性G6PD缺陷的发生率为7.31% (19/260); 女性为4.35 (10/230). PCR-DHPLC-Sequencing 或PCR-Direct Sequencing分析19个阿昌族无关个体G6PD基因外显子2~13, G6PD Mahidol (487G>A)的突变率为84.2% (16/19); 所有G6PD Mahido均与新的多态性IVS5-612 (G>C)连锁. G6PD 487G>A/IVS5-612 (G>C) 构成新的单体型成为这一阿昌族群体G6PD缺陷的分子特征之一, 已提交GenBank (登录号: EF190463). 阿昌族G6PD Mahidol 的高发与缅甸人群G6PD Mahidol 突变率 (91.3%, 73/80) 极为相似, 这一结果提示阿昌族与缅甸人群之间有着广泛的基因交流 (gene flows). 而中国其他少数民族最常见的突变G6PD Canton (1376G>T) 和G6PD Kaiping (1388G>A) 在这一阿昌族人群中没有找到, 提示阿昌族与其他少数民族的G6PD基因突变热点不同. 本研究数据是有关阿昌族G6PD遗传学的首次报道, 将为研究阿昌族起源、迁移提供线索并有助于上述地区疟疾的防治.     

敲减NADPH氧化酶4能降低STAT3活性抑制人黑色素瘤A375细胞的增殖

NADPH氧化酶参与细胞活性氧族（ROS）的生成过程,而ROS与肿瘤细胞增殖密切相关. 为了阐明NADPH氧化酶影响黑色素瘤A375细胞增殖的分子机制,本文首先应用荧光定量PCR和Western 印迹证实NOX4为人黑色素瘤A375细胞的NADPH氧化酶功能核心亚基;随后根据NOX4基因设计3条干扰序列和对照序列并连接到pSuper-retro-puro载体,经鉴定后转化E.coli DH5α感受态细胞、筛选有效干扰序列并用于逆转录病毒包装,病毒液感染A375细胞并经嘌呤霉素筛选10 d,构建了NOX4缺陷的A375稳转细胞珠（A375 NOX4Δ）,其NOX4的mRNA和蛋白表达分别下降了66.02%和77.35%,伴随NADPH氧化酶活性和ROS水平分别下降了79.17%和64.16%;MTT、EdU法检测显示,A375-NOX4Δ细胞的增殖能力比A375-WT细胞明显降低、倍增时间延长,增殖细胞数量下降了68.27%（P＜0.01）,呈现G1→S期阻滞;Western blot检测表明A375 NOX4Δ细胞的 cyclin D1、CDK4分别下降了55.7%（P＜0.01）和64.8%（P＜0.01）,而P53、P21分别增加了6.89 倍（P＜0.01）和3.27 倍（P＜0.01）,STAT3、P-STAT3分别下降了51.80%（P＜0.05）和82.58%（P＜0.01）;电泳迁移率变动分析（EMSA）表明,A375 NOX4Δ细胞的STAT3-DNA结合活性明显降低. 上述结果提示,敲减A375细胞的NOX4表达可能通过减少ROS生成使得STAT3磷酸化水平及其结合DNA的活性下降,最终导致A375-NOX4Δ细胞增殖减少、呈现G1→S期阻滞,这为黑色素瘤发病机制研究提供了新思路及可能的药物作用靶点.     

黑色素瘤发生发展中的表观遗传学调控

人恶性黑色素瘤(malignant melanoma)是近年来高发病率和高死亡率的肿瘤之一.目前尚缺乏有效的治疗方法.而表观遗传如DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰(histonemodification)、染色质重塑(chromatin remodeling)及RNA干扰(RNA interference,RNAi)等改变在人黑色素瘤的发生、发展和转移中有重要作用.阐明黑色素瘤发生发展的表观遗传学机制已引起了学者的普遍关注.本文综述了人类黑色素瘤发生发展中所特异的表观遗传改变:CpG岛的异常甲基化修饰、组蛋白甲基化和乙酰化修饰、染色质重塑以及microRNA在黑色素瘤发生和转移中的作用,并对应用表观遗传修饰治疗人类黑色素瘤进行了探讨.     

葡萄糖6-磷酸脱氢酶调控细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白依赖性激酶2促进细胞增殖及其在肾透明细胞癌中的预后价值

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是一种转移率高、预后差的细胞代谢性疾病,对其有效诊疗及预后分子标志物的研究十分重要。葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase, G6PD)在ccRCC中高表达,并提示患者不良预后,其促进ccRCC细胞增殖的分子机制有待进一步揭示。本研究发现,降低G6PD可抑制细胞周期G₁/S期转化并显著抑制ccRCC细胞增殖。G6PD可在细胞水平调控G₁/S期转化及增殖相关因子Cyclin D1,CDK4,CDK6,Cyclin E1和CDK2基因表达。TCGA数据库分析结果表明,ccRCC 中Cyclin D1,Cyclin E1 和 CDK2的mRNA 水平显著升高,而CDK4表达无明显差异,CDK6表达却显著降低。相关性分析结果显示,G6PD与Cyclin D1呈显著负相关(P<0.0001),G6PD与CDK4,CDK6之间无显著相关性(P>0.05),G6PD与Cyclin E1(P<0.0001)以及CDK2(P<0.05)显著正相关。进一步免疫组化检测结果表明,Cyclin E1和 CDK2在ccRCC肿瘤组织中表达显著升高。生存预后分析结果显示,Cyclin D1高表达提示ccRCC患者整体预后更为良好,CDK4和CDK6表达水平在ccRCC患者总生存率预测中无意义;而Cyclin E1和CDK2高表达均可提示ccRCC患者预后不良。进一步细胞水平检测发现,Cyclin E1、CDK2表达降低可显著逆转G6PD促进ccRCC细胞增殖的能力。综上,与增殖相关因子Cyclin D1,CDK4和CDK6相比,G6PD有可能通过促进Cyclin E1和CDK2表达升高而发挥促进 ccRCC肿瘤细胞增殖的作用,并且这3者的异常高表达有望成为ccRCC患者不良预后的独立生存预测因素。     

siRNA沉默G6PD表达对人皮肤黑色素瘤细胞生长及凋亡的影响

研究表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与肿瘤的发生、发展、临床表型及治疗和预后有关.为阐明G6PD与肿瘤的关系及其机理,针对人G6PD基因设计3条siRNA和一条无关序列,再据每一序列,合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA,退火后与含GFP的载体pRNAT-u6.2/Lenti连接,转染人皮肤黑色素瘤A375细胞,Real-time PCR筛选有效的一条siRNA,经病毒颗粒包装和病毒生产并感染A375细胞,G418筛选后,挑取单个阳性克隆放大培养,Western blotting检测siRNA干扰G6PD效率为88.83%,构建成G6PD缺陷型A375稳转细胞(A375-G6PDA).与野生型A375细胞(A375-WT)比较,A375-G6PD△的G6PD活性仅为21.53%,细胞倍增时间延长,增殖被抑制,克隆形成率降低25%(P0.05),提示,G6PD缺陷可能通过下调P53蛋白表达和上调Caspase.3的表达,抑制G2/M期向G0/G1期转换的进程,促进A375的凋亡,机理有待于进一步探讨.     

云南阿昌族G6PD基因突变G487A在DF213中的表达

为获得阿昌族G6PDWT和G6PDG487A重组蛋白,研究G6PDG487A的结构和功能改变,从云南省德宏州梁河县杞木寨乡湾中村阿昌族聚集地的G6PD缺陷家系先证者和正常阿昌族个体全血提取RNA,经RT-巢式PCR得cDNA,将cDNA克隆至pMD18-Tsimple载体中并测序;错配碱基经定点突变修复后,目的基因亚克隆至pThioHis(A)载体,构建了阿昌族G6PD基因野生型和G487A突变型原核表达载体:pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A。用重组质粒转化E.coli Competent Cells DF213(G6PD defeciency),经IPTG诱导G6PD表达、10%SDS-PAGE电泳检测表达蛋白和紫外340nm定量测定G6PD活性的分析表明,pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A在DF213中成功表达,分子量约为59kDa。IPTG诱导0、3、6、9、和12h后,G6PD活性逐渐增高,G6PD基因WT表达的酶活性约是G487A的20-25倍。表达载体的构建以及G6PDcDNA在DF213中成功表达,为重组酶G6PDG487A的进一步研究奠定了基础。