大蜡螟中类肽聚糖识别蛋白Gm21的鉴定、基因克隆及序列分析

为了调查毒素蛋白免疫下大蜡螟Galleria mellonella L.产生的免疫相关蛋白,采用双向电泳的方法,从大蜡螟血淋巴中鉴定得到一种昆虫肽聚糖识别蛋白Gm21,通过RT-PCR、cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到其全长基因,该基因全长cDNA具有完整的编码框,编码211个氨基酸,序列分析表明该蛋白是一种具有潜在酰胺酶活性的S型肽聚糖识别蛋白.本研究中Gm21蛋白在免疫压力下的上调表达及其cDNA序列的克隆,对进一步深入研究昆虫肽聚糖识别蛋白的功能具有重要的意义.     

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut 表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

抗生素对微生物作用的研究

抗生素能干扰微生物细胞新陈代谢的某个或几个环节 (包括代谢物或酶系统 ) ,使它不能以正常的代谢途径维持和延续生命活动。分别从抗生素抑制细胞壁合成、影响细胞膜功能、抑制蛋白质合成、影响能量代谢、干扰核酸合成 5方面综述了抗生素对微生物的作用。     

拟双角斯氏线虫D43品系鞘蛋白对大蜡螟幼虫的免疫抑制作用

侵染期的拟双角斯氏线虫Steinernema ceratophorum D43品系体外都包裹着一个透明的体鞘。为探明体鞘对线虫侵染力的影响, 了解鞘蛋白（sheath proteins, SPs）对大蜡螟Galleria mellonella 幼虫的免疫抑制作用, 本研究通过化学方法使拟双角斯氏线虫D43脱鞘, 以对寄主的致死率和侵入点数量为指标, 与包鞘线虫比较对大蜡螟幼虫的侵染力; 采用乙醇提取的方法获得线虫鞘蛋白, 利用双向电泳和质谱技术对鞘蛋白进行鉴定分析; 从血细胞数量和酚氧化酶活力两个方面评价鞘蛋白对大蜡螟幼虫免疫反应的抑制作用。结果表明： 0.5%次氯酸钠处理20 min可以保证95%以上的线虫存活和脱鞘。与包鞘线虫相比, 脱鞘线虫对大蜡螟幼虫的致死率显著降低, 致死时间延后, 节间膜侵入点数量显著减少。以35%乙醇提取的鞘蛋白提取物可鉴定出6种鞘蛋白, 其中一个被鉴定为丝氨酸蛋白酶。此外, 血腔注射鞘蛋白提取物可导致试虫血细胞数量明显降低, 酚氧化酶活力受到显著抑制。由此说明, 体鞘对拟双角斯氏线虫D43的侵染力具有显著影响, 鞘蛋白在抑制寄主昆虫免疫反应中发挥重要作用。     

原生质体融合提高农抗武夷菌素的效价

从农抗武夷菌素产生菌不吸水链霉菌武夷变种菌株Co-N-31诱变获得两个突变株M35(Leu^-,孢子颜色灰色)和M46(ser^-.孢子颜色灰白色),并以此两突变株为直接亲本在25％ PEG1000诱导下进行种内原生质体融合。M35和M46原生质体再生率分别为3.72％和0.248％,重组频率为55.20％。采用间接法选择营养标记互补的稳定的原养型重组子,并从中获得一株高产菌株F31-24;其效价比原始亲本Co-N-31提高了82％。薄层层析结果表明,菌株F31-24和Co-N-31的发效产物在Rf值为0.50和0.26处均有斑点,但含量有异。测定斑点生物活性证明其均有抑菌活性。温室试验表明,菌株F31-24发酵产物对小麦白粉病的防治效果优于菌株Co-N-31。     

嗜线虫致病杆菌Xna基因同源重组载体的构建及遗传转化体系的建立

构建嗜线虫致病杆菌Xna基因的同源重组载体和建立该细菌的遗传转化体系.扩增嗜线虫致病杆菌XNA基因的左右同源片段及质粒PEASY-T1上的卡那抗性基因Km;利用重叠延伸引物PCR法将这3个片段连接起来,然后将其克隆至自杀性载体PJQ200.采用电激法将同源重组载体DNA转化到供体细菌,再利用二亲本结合转移方法将供体细菌中的载体转化到受体细菌CB6菌株.结果成功地扩增了Xna基因的左右同源臂及卡那抗性基因的全长融合片段、构建了Xna基因的同源重组载体,并建立了嗜线虫致病杆菌北京变种的遗传转化体系.     

提高蛋白激发子产量的培养基及发酵条件的优化

为了进一步提高极细链格孢菌产蛋白激发子的产量,通过单因子和多因子试验与分析,筛选优化了适于极细链格孢菌产生蛋白激发子的培养基和培养条件,并检测了发酵过程中pH、还原糖、氨基氮和菌丝量变化以及与蛋白激发子产量的关系。结果表明,土豆淀粉和黄豆粉对蛋白激发子产量影响最大,其次是蛋白胨和无机盐。优化的发酵培养基主要成分（g／L）：碳源I 15、葡萄糖5、玉米淀粉5、土豆淀粉20、谷氨酸10、氮源I5、黄豆粉10、硫酸铵5。确定了优化的培养条件,调整培养基起始pH为7．0～7．5,将18h菌龄的种子培养液按10％接种量接种到装液量为75mL的500mL摇瓶中,在温度（28±1）℃、摇床转速180r／min下培养可获得理想的蛋白产量。在优化的培养基和培养条件下,发酵12～48h该菌进入对数生长期,48h进入稳定生长期,60h菌丝扣蛋白激发子产量达最高。蛋白产量与菌体生物量呈正相关,当还原糖、总糖量消耗到最低水平时,菌丝产量和蛋白激发子产量达最高。优化的培养基菌丝干重收率迭3．9g／100mL,蛋白激发子产量达到5．17g／L,比普通的土豆液体培养基提高近4倍。     

激发子基因peaT1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有激发子基因peaT1的植物表达载体pCAM-BIA2300-G4AS-peaT1转化三生烟,获得了转基因烟草植株。用PCR检测确认了阳性转化株,用Southern杂交、RT-PCR和Western杂交进一步证实了peaT1基因的整合、转录和表达。对T1代转基因阳性株进行TMV接种试验,结果显示,与非转基因对照相比,表达peaT1的烟草叶片枯斑数量减少,表明蛋白激发子基因peaT1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

农杆菌介导拒食蛋白XnAFP2转化恢复系多系一号的研究

拒食蛋白是从嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株分离得到的对多种昆虫具有拒食、抑制生长发育作用的毒性蛋白,通过根癌农杆菌介导转化法将极拒食蛋白基因导入XnAFP2多系一号基因组,获得了转基因水稻植株.通过PCR、RTPCR和Southern blot验证目的基因的整合和表达.     

蛋白激发子PeaT1在枯草芽胞杆菌中的分泌表达及重组菌株提高小麦抗旱和促生的作用

PeaT1是从极细链格孢菌Alternaria tenuissima中分离的一种蛋白激发子,具有促进植物生长和诱导植物产生系统获得抗性的功能,为了实现peaT1基因在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中的分泌表达,增加其应用途径,从枯草芽胞杆菌基因组DNA中分别扩增获得P43启动子和nprB基因的信号肽序列,并用SOE (Splicing by over lapping extension) 方法与peaT1基因连接,将连接产物克隆到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭表达载体pHY300-PLK上,构建了重组表达载体pHY43N-peaT1。将重组载体转化枯草芽胞杆菌WB800菌株,SDS-PAGE和Western blotting分析证实,在NprB信号肽的引导下,枯草芽胞杆菌成功分泌表达了PeaT1蛋白。构建的重组菌株能够显著增强幼苗抗旱性,提高小麦株高。