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目的:构建并包装针对HTRA1基因以及其1091TC突变基因(HTRA1-Mut)的过表达慢病毒载体,以及建立稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)株。方法:采用RT-PCR方法扩增HTRA1及HTRA1-Mut基因片段并将其连接于GV287载体质粒,采用慢病毒包装三质粒系统(GV287/p Helper 1.0/p Helper 2.0)转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并标定病毒滴度,慢病毒感染经培养和鉴定的HBVSMC细胞株。结果:成功构建含HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒重组载体,PCR鉴定阳性的克隆进行测序和BLAST比对分析显示与源基因序列一致,并能够有效的感染并在293T细胞中表达。表达载体包装后测定病毒滴度为:2E+8 TU/mL。过表达慢病毒感染后HBVSMC有荧光表达,并且荧光率达80%以上,细胞生长良好传后细胞几乎无死亡现象。结论:成功构建了过表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒表达载体,得到了较高滴度的病毒悬液,建成了稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的HBVSMC细胞株,为进一步探讨HTRA1基因及突变后细胞的功能变化提供了良好的研究工具。 相似文献
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1 临床资料 患者 ,女 ,48岁 ,于 2 0 0 1年 1 2月 3 1日服甲基乙硫磷约 2 5 0 ml,被发现时已有意识障碍 ,即在当地医院按有机磷中毒抢救。患者昏迷 5天后才苏醒 ,四肢活动无力 ,卧床 1月余 ,期间时有出汗 ,治疗 1个月后出院。出院时双上肢可上举 ,肌力差 ,双下肢可活动但不能站立 ,二便正常。发病 40天后又出现四肢发麻 ,双下肢胀痛 ,四肢无力加重 ,约 3天后双下肢完全不能活动 ,上肢稍能活动。再次入院 ,既往健康。检查 :血压 2 0 /1 0 .7k Pa,颅神经 (- ) ;四肢肌张力低 ,腱反射消失 ,无明显肌萎缩 ,双上肢肌力 级 ,双下肢肌力 级 … 相似文献
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