表达结核分枝杆菌CFP10基因的重组腺病毒对A549细胞炎性因子的影响

通过构建表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）CFP10基因的重组腺病毒,探讨CFP10蛋白对A549细胞炎性因子表达的影响。采用酶切、连接的方法将CFP10编码基因插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-AdV4中,构建重组穿梭质粒pShuttle-AdV4-CFP10,重组穿梭质粒经测序验证后和骨架质粒pGP-Ad-Pac Vector经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后共转染至HEK 293A细胞中进行病毒包装,获得重组腺病毒AdV4-CFP10,经定量PCR和Western blot验证后进行病毒扩增,CsCl密度梯度离心纯化获得高纯度的重组腺病毒。AdV4-CFP10感染Ⅱ型肺泡上皮细胞A549,利用荧光定量PCR和ELISA技术检测A549细胞中细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α等的表达水平,初步探究CFP10对A549细胞炎性因子分泌的影响。成功构建了表达结核分枝杆菌CFP10基因的重组腺病毒AdV4-CFP10,AdV4-CFP10转染至A549细胞后,与空病毒相比,过表达CFP10显著上调A549细胞炎性因子的分泌水平。为进一步深入研究结核分枝杆菌CFP10蛋白对A549细胞炎性反应的调控机制提供参考。     

结核分枝杆菌CFP10和ESAT6对巨噬细胞RAW264.7凋亡及AIM2/ASC/Caspase-8通路的影响

【背景】10 kD培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10,CFP10)和6 kD早期分泌性抗原靶蛋白(early secretary antigenic target-6 kD,ESAT6)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)重要的毒力因子,能引起巨噬细胞的凋亡。【目的】探讨CFP10和ESAT6对巨噬细胞RAW264.7凋亡及AIM2/ASC/Caspase-8信号通路的影响。【方法】利用大肠杆菌表达并纯化获得了CFP10和ESAT6蛋白,重组蛋白处理巨噬细胞RAW264.7后,利用CCK8试剂盒检测细胞存活率,确定重组蛋白处理细胞浓度,利用Western blotting技术检测细胞凋亡相关蛋白及AIM2和ASC炎性小体的变化,利用流式细胞术检测细胞凋亡率。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果表明重组蛋白CFP10和ESAT6表达正确,不同浓度的CFP10和ESAT6处理RAW264.7后,对细胞的增殖能力具有明显的抑制作用,当CFP10和ESAT6单独处理且浓度为5 μg/mL时,细胞存活率较对照组有显著下降(P<0.001),且随着蛋白浓度的增加细胞存活率显著下降(P<0.001)。Western blotting结果表明,CFP10和ESAT6蛋白单独处理巨噬细胞24 h后均能引起巨噬细胞发生凋亡。当终浓度为5 μg/mL的CFP10和ESAT6共处理巨噬细胞时,共处理组凋亡相关蛋白BAD、CHOP、Caspase-8和Caspase-3较ESAT6单独处理组有极显著差异(P<0.001),说明CFP10和ESAT6共处理显著降低了ESAT6单独处理引起的巨噬细胞的凋亡,进一步研究发现ESAT6能激活AIM2、ASC炎性小体。【结论】结核分枝杆菌CFP10和ESAT6处理RAW264.7后均能引起巨噬细胞发生凋亡,当二者共处理时,CFP10会显著降低ESAT6单独处理引起的细胞的凋亡,进一步的研究表明,ESAT6可能通过激活AIM2/ASC/Caspase-8信号通路从而引起巨噬细胞发生凋亡。研究结果为进一步探究Mtb感染过程中CFP10和ESAT6蛋白对巨噬细胞凋亡的调控作用及其分子机制奠定了基础。     

宿主感染马红球菌的免疫机制

马红球菌(Rhodococcus equi)作为一种人兽共患病原菌,主要引起3～6月龄马和免疫缺陷患者肺部相关疾病,病死率为50%～80%;此外还可以感染猪、羊、猫、狗、骆驼等动物。该菌不仅对马业造成严重经济损失,还危害免疫缺陷患者的健康,因此在世界范围内受到公共卫生学的重视。马红球菌感染宿主后,其通过抑制吞噬体/自噬体与溶酶体的融合抵抗巨噬细胞杀伤从而进行免疫逃逸;此外,由于马驹固有免疫和适应性免疫存在功能缺陷使其不能有效抵抗马红球菌感染。目前关于宿主感染马红球菌的免疫机制尚未阐述清楚,从马红球菌与宿主免疫细胞相互作用的角度出发,就宿主感染马红球菌的免疫机制进行综述,以期更好地了解马红球菌感染的免疫机制,同时为该菌所引发疾病的防治策略提供参考。     

胞外和胞内菌胞外囊泡的功能及应用

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)是从细胞膜上脱落或者分泌的双层膜结构的囊泡状小体。真核生物、细菌、古细菌和支原体等具有细胞结构的生物均能够释放EVs。细菌分泌的EVs含有DNA、RNA及蛋白质等多种成分,其在细菌毒力保持、免疫逃逸、细菌间物质运输、宿主细胞免疫调节、宿主转录基因调节、耐药性等方面发挥巨大作用。细菌可以分为胞内菌(Intracellular bacteria)和胞外菌(Extracellular bacteria),二者EVs在释放机制、生理学功能和临床应用等方面存在着区别与联系。就胞内菌和胞外菌的囊泡分泌机制、功能及应用作一阐述。