棉铃虫核多角体病毒iap3基因表达时相分析

目的:原核表达棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)iap3基因,制备该蛋白的多克隆抗体,并利用该抗体分析iap3基因在病毒感染过程的表达时相,为深入研究提供基础.方法:PCR扩增iap3基因后,克隆至pET28b,转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,利用亲合层析进行蛋白纯化,将纯化融合蛋白免疫大鼠制备抗血清,利用抗血清Western blot检测IAP3在病毒感染过程的表达时相.结果:成功在原核细胞中表达iap3基因,并获得纯化的融合His - tag的IAP3蛋白,制备了该蛋白的多克隆抗体.发现iap3基因最早在感染后24h表达,到72h到达表达高峰.结论:获得了IAP3多克隆抗体,iaP3基因是一个晚期表达基因.     

杆状病毒P6.9蛋白的表达及自身互作研究

目的:在大肠杆菌中表达苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒P6.9蛋白并制备抗体,研究P6.9的自身互作。方法:用PCR方法扩增p6.9基因,将其分别克隆到原核表达载体pMAL-c2x、pGEX-4T-1、pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。选取可溶性较好的融合蛋白纯化后免疫家兔制备抗体。然后利用该抗体进行Western blot检测、分析P6.9的自身互作。结果:构建了pMAL-P6.9、pGEX-P6.9、pET-P6.9三种原核表达质粒,分别在大肠杆菌中经IPTG诱导表达产生了与预期分子量相符的MBP-P6.9(49.4kDa)、GST-P6.9(32.9kDa)、HIS-P6.9(12.5kDa)融合蛋白。制备了P6.9的多克隆抗体,能与P6.9蛋白发生特异反应。Pull-down结果表明P6.9自身互作。结论:获得了兔抗P6.9的多克隆抗体,为深入研究P6.9的功能提供了检测工具。证明了P6.9之间的互作,说明该蛋白功能的发挥可能是通过多聚体起作用的。     

美洲棉铃虫细胞中dsRNA介导的egfp基因沉默分析

为了分析在美洲棉铃虫细胞( HzAM1)内RNAi的效果,将egfp基因克隆到含有双向T7启动子/终止子的质粒载体中,在体外合成全长的增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因dsRNA,将dsRNA和含有能在昆虫细胞内表达eGFP的质粒一起转染HzAM1细胞,分析dsRNA对eGFP表达的抑制作用.结果显示,由egfp基因转录的长dsRNA能有效抑制HzAM1细胞内eGFP的表达,而且该抑制作用表现为剂量依赖效应.但是抑制作用并不彻底,在高剂量的dsRNA处理下,仍有部分细胞内能观察到eGFP的表达.