钝齿棒杆菌溶氧诱导型启动子的筛选及其功能验证

[目的]筛选钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5内源溶氧诱导型启动子,验证其在不同溶氧条件下受溶氧调控的功能.[方法]以本课题组前期利用双向电泳结合质谱鉴定技术分离鉴定出的高低供氧条件下钝齿棒杆菌SYPA5-5胞内的显著差异蛋白(27个)为基础,结合棒杆菌基因组信息分析高低溶氧状态下显著差异蛋白中单位拷贝的表达量,以其中单位拷贝表达量高的蛋白为目的蛋白,克隆目的蛋白编码基因的上游启动子,分别替换棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pDXW-8的外源tac启动子,在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中表达报告基因gfp和cat,并检测其表达效率.[结果]筛选出高溶氧上调蛋白转酮醇酶和延胡索酸水化酶作为目的蛋白,克隆其启动子区命名为P-tkt和P-fum.在重组大肠杆菌和重组钝齿棒杆菌中,P-tkt在高溶氧条件下CAT活性是低溶氧条件下CAT活性的2.8和3.2倍.该结果在5L发酵罐中得到验证.[结论]启动子P-tkt为首次筛选到的钝齿棒杆菌内源性高溶氧诱导型启动子,适用于高溶氧条件发酵生产氨基酸的菌株中,有利于在高供氧条件下提高棒杆菌中氨基酸的合成代谢能力.     

利用N糖苷酶F对单克隆抗体N糖酶解条件的优化

为了优化利用N糖苷酶F（PNGase F）酶解单克隆抗体中N糖的方法，应用本公司生产的单抗对PNGase F酶的酶解条件进行优化，包括缓冲液pH、酶种类、仪器、酶解程度、变性缓冲液及酶加入量等，总结酶解条件对N糖谱结果的影响。结果显示，置换缓冲液至1×PBS中可以避免某些单抗在低pH酶解时G0F转化为G0F-GN并可改善峰型；快速PNGase F和加入变性缓冲液能有效提高酶解效率；UPLC和1.7 μm粒径色谱柱能提高分离度；不完全酶解影响N糖含量结果。研究结果表明，采用优化的酶解条件可快速、有效的酶解单抗上的N糖，使N糖谱结果准确可靠，为细胞株筛选和单抗药物质量控制提供有效手段。