克雷伯氏菌甘油脱氢酶dhaD的克隆表达、纯化及酶学性质研究

以克雷伯氏菌基因组DNA为模板,扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因dhaD,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,在E.coliBL21（DE3）中诱导表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6·His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的甘油脱氢酶(GDH),纯化后比酶活达到156U/mg,纯化倍数达4.6倍,回收率为67.4%。并初步研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适pH为11.0,在pH7.0～12.0范围内稳定;酶反应的最适温度为30℃,稳定范围为25～45℃; 酶动力学参数以甘油为底物的Km为0.54 mmol/L, Vmax为0.49 μmol/(mL·min)。     

重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸培养基的优化

【目的】提高重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe)的产量。【方法】使用正交试验设计以及响应面优化法分别对种子培养基及发酵培养基进行优化,确定了重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe的最佳种子培养基及最佳发酵培养基。【结果】重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe最佳种子培养基(g/L):葡萄糖25.0,玉米浆25.0,硫酸铵15.0,硫酸镁1.0,磷酸二氢钾2.0,尿素2.0,p H 6.8-7.0;最佳发酵培养基(g/L):葡萄糖110.0,玉米浆7.0,硫酸铵25.0,硫酸镁1.0,磷酸二氢钾1.0,柠檬酸钠2.0,谷氨酸1.0,碳酸钙25.0,p H 6.8-7.0;在最佳培养基条件下L-Phe产量最高达到9.14 g/L,较优化前的7.46 g/L提高了22.5%。【结论】通过正交试验和响应面分析对重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe培养基进行优化,明显提高了L-Phe的产量,并确定了葡萄糖、玉米浆和硫酸铵为发酵培养基中影响L-Phe产量的3个关键因子。研究结果为L-Phe的发酵放大提供了依据。