橡胶树炭疽菌蛋白激酶A催化亚基基因的克隆及表达

为了解蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)的生长发育和致病性中的功能。本研究利用同源克隆法设计引物,采用PCR和RT-PCR的方法获得炭疽菌(C. siamense)的PKA两个催化亚基PKA-C1与PKA-C2,并基于RSF-Duet载体构建两基因原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达,利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果表明:催化亚基PKA-C1编码498个氨基酸,包含3个内含子;PKA-C2基因编码381个氨基酸,包含2个内含子;两基因均含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和S_TK_X;聚类分析显示两基因与胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)依赖cAMP蛋白激酶催化亚基序列有高度同源性。SDS-PAGE检测表明目的基因在大肠杆菌中可成功表达,大小符合预期。本研究结果为进一步分析炭疽菌的PKA催化亚基基因功能提供了帮助。     

启动子探针载体的构建及橡胶树白粉菌启动子筛选鉴定

旨在构建适于快速检测橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)HO-73启动子的探针载体。以卡那霉素抗性基因Kan作为报告基因,在pUC19骨架载体,构建获得启动子探针载体pUC19-K,连入CaMV35S启动子做启动子探针载体功能验证;利用启动子探针载体pUC19-K对预测的启动子片段LY1、LY2、LY3、LY4进行筛选鉴定。将CaMV35S启动子连入到启动子探针载体中,得到可检测启动子活性的启动子探针载体pUC19-K;应用生物信息学软件对部分橡胶树白粉菌HO-73全基因组数据预测,得到4个理论上具有活性的启动子序列LY1、LY2、LY3、LY4,利用构建的启动子活性探针载体进行活性比较,卡那耐受性实验检测发现含LY2和LY3的菌株随卡那霉素浓度的升高耐受性更强,最终得到2个活性较强的启动子LY2和LY3。以上结果表明,构建的启动子活性探针载体可以有效、灵敏地用于HO-73强启动子的筛选和启动子活性检测。     

橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)疏水蛋白Hydr基因的克隆与原核表达

为了研究Hydr在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌疏水蛋白Hydr基因,并利用原核表达系统对其进行表达.结果显示:Hydr基因DNA为520bp,cDNA为417 bp,编码139个氨基酸,包含2个内含子,在蛋白的N端含有由19个氨基酸组成的一段信号肽;分别构建了含信号肽的Hydr-PET-32a和缺失信号肽的Hydr(-18aa)-PET-32a的融合表达载体.利用SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白表达情况,结果表明该蛋白在去除信号肽的情况下,供试条件下(IPTG 0.4 mmol/L,0.6 mmol/L,0.8 mmol/L,1.0 mmol/L;温度16℃)均可表达,但保留信号肽时,在菌体上清和包涵体以及细胞培养液中均未获得融合蛋白,表明信号肽的存在会影响疏水蛋白Hydr原核表达.本研究结果为进一步验证疏水蛋白与脂滴包被蛋白的互作,以及疏水蛋白在橡胶树炭疽菌的功能分析提供理论依据.     

橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因克隆及蛋白表达纯化

由橡胶树白粉菌引起的橡胶树白粉病是橡胶树的重要的叶部病害之一,严重影响橡胶的产量。然而目前对橡胶树白粉菌的致病机理研究匮乏。分支酸变位酶是莽草酸途径的关键酶,能够将分支酸转化为预苯酸,为植物提供氨基酸及大量代谢产物,在植物抗病中起到非常重要的作用。而植物病原物在致病过程当中能够分泌分支酸变位酶影响植物莽草酸途径,从而抑制植物的防卫反应。因此研究橡胶树白粉菌分支酸变位酶在其致病过程中的功能具有一定的意义。试验利用同源比对分析在橡胶树白粉菌基因组中获得一个分支酸变位酶同源蛋白,并用PCR克隆获得橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因,命名为OHCmu。后续构建GST-OHCmu融合原核表达载体,筛选最优诱导条件,并利用GST亲和层析柱对蛋白进行纯化。结果表明橡胶树白粉菌OHCmu基因大小843 bp,具有1个内含子,编码263个氨基酸;具有d5csma_结构域,属于Chorismate mutaseⅡ蛋白家族;GST-OHCmu融合蛋白外源诱导表达在供试条件下(IPTG:0.8 mmol/L, 16℃)可以有较好的表达,获得融合蛋白大小约为56 kD。经过GST亲和层析柱纯化、切割GST标签后,顺利获得浓度较高、较纯的橡胶树白粉菌OHCmu蛋白。研究结果为后续OHCmu蛋白的特性及致病机理研究提供参考。