肝细胞Lamp-2a时间特异性基因敲除大鼠的构建及评估

目的:构建肝细胞Lamp-2a时间特异性基因敲除大鼠模型(L2AKO)并对其评估,为后续胆汁酸代谢研究提供研究基础。方法:将引进的Lamp-2~(aloxp/-)大鼠和Alb-Cre~(ERT2)工具鼠杂交繁殖,得到基因型Lamp-2a~(loxp/-)Alb-Cre~(ERT2+)大鼠;后者再与Lamp-2a~(loxp/loxp)杂交得到双臂loxp阳性和Alb-Cre~(ERT2)阳性的大鼠,于4-6周时经他莫昔芬的诱导实现对肝细胞Lamp-2a基因的时间特异性敲除。分别通过qPCR方法、Western-Blot技术、免疫组织化学方法对Lamp-2a的敲除结果进行验证。结果:免疫组织化学结果显示:该模型可选择性敲除肝细胞Lamp-2a,而肾脏Lamp-2a正常表达;Western和qPCR结果显示肝脏Lamp-2a的水平明显降低。L2AKO与WT大鼠相比体重变化无明显差别。肝功生化检测发现L2AKO大鼠AST明显高于WT组大鼠。结论:采用Cre/loxp系统及他莫昔芬诱导的方法成功构建肝细胞Lamp-2a时间特异性基因敲除大鼠,并且L2AKO大鼠生长未受影响,为胆汁酸代谢研究建立了较好的动物模型。     

自噬参与原发性胆汁性胆管炎患者Th17/ Treg免疫失衡的研究

目的:Th17/Treg免疫失衡在原发性胆汁性胆管炎(PBC)的发病机制中起到关键作用。自噬是调节T细胞稳态的重要环节。本研究旨在探索自噬对PBC患者Th17/Treg免疫失衡的影响。方法:选取20例初次诊断的PBC患者,20例健康对照者,收集其外周血单个核细胞(PBMCs)。利用流式细胞术检测PBC患者与健康对照者PBMCs中Th17和Treg细胞分布及其胞内自噬的水平,进一步体外利用氯喹抑制自噬,证实自噬对PBC患者Th17/Treg平衡的影响。结果:相较于健康对照者,PBC患者Th17细胞占CD4~+T比例上升(P0.05),且血清中IL-17含量较高(P0.01);Treg细胞比例下降(P0.05),且血清中TGF-β含量较低(P0.01)。而PBC患者Th17细胞和Treg细胞内自噬水平均升高。另外,体外实验结果证实,自噬抑制剂氯喹能够有效地恢复PBC患者PBMCs中Th17/Treg平衡。结论:异常活化的自噬可导致PBC患者Th17/Treg免疫失衡,抑制自噬能够在体外恢复此平衡。因此,对异常自噬的干预可能将成为PBC疾病治疗的新方法。     

利用流式细胞术评价长期冻存对PBMCs各亚型的影响

目的:利用流式细胞术,检测长期冻存后PBMCs总数及各亚型的变化,评价PBMCs的长期冻存效果。方法:收集志愿者外周血PBMCs,利用流式细胞术分析液氮冻存后PBMCs细胞总数及其亚型的变化。结果:长期冻存后,PBMCs总细胞量和细胞活力无显著改变(P=0.19, P=0.32);T细胞、NK细胞和NKT细胞比例无明显变化,但B细胞比例增多(P0.01),单核细胞比例显著减少(P0.001);低温保存影响活化的T细胞和Tregs细胞数量(P0.05, P0.05),其中初始Tregs和记忆Tregs显著减少(P0.05,P0.01)。结论:PBMCs长期冻存会影响B细胞,单核细胞、活化T细胞和Tregs细胞的活性。