基于CRISPR/Cas9系统构建裸鼹鼠HIF-1α基因敲除质粒及其功能验证

目的 利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts, NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。方法 针对裸鼹鼠HIF-1α基因的1～4号外显子区域设计4对sgRNA序列,并成功构建表达质粒。筛选得到最优sgRNA后,转染HEK-293T细胞收集上清液测定病毒滴度。前期用pLenti-Cas9(blast)病毒感染NSF细胞,后用制备的HIF-1α-sgRNA病毒感染表达Cas9蛋白的NSF细胞。经药筛后观察荧光表达,同时提取细胞gDNA和蛋白。通过T7E1酶和Western Blot检测NSF细胞中HIF-1α基因变化及蛋白表达情况。结果Sanger测序显示,所设计的sgRNA成功插入到pX459和pKLV2-U6-sgRNA2载体上,序列验证正确,重组质粒构建成功;T7E1酶切实验成功切除3条带,sgRNA的打靶效率为54%,Western Blot结果表明,经药筛后的裸鼹鼠NSF细胞HIF-1α基因敲除成功,蛋白水平显著降低(P=...     

管氏肿腿蜂不同类型种蜂的繁蜂效果研究

经连续多代利用中间寄主黄粉甲人工扩繁管氏肿腿蜂后,种蜂出现一定退化,主要表现为寄生率和寄生成功率下降、单管出蜂量减少、子代蜂体型趋小等等。种蜂退化与繁育寄主的营养状况、种蜂保藏条件和接蜂繁育条件等因素有关。本研究根据设定的形态差异标准把种蜂划分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型种蜂,将3种类型种蜂分别进行繁育试验,统计比较各型种蜂的母代寄生率、寄生成功率、单管出蜂量、子代性比、存活率等参数,确定在人工扩繁应选用的种蜂类型。结果表明:Ⅰ型种蜂经50 d的适宜条件保藏后,以3∶1蜂虫比接蜂繁育,繁育效果更佳。