干酪乳杆菌arat基因的敲除及其对苯乳酸合成代谢的影响

苯乳酸（PLA）作为一种新型的广谱抑菌物质,在食品行业具有巨大的发展潜力,作为乳酸菌的天然代谢产物之一,对其代谢机理的研究具有非常重要的意义。通过CRISPR/Cas9基因编辑系统对一株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）1.8727的芳香族氨基转移酶基因arat进行敲除,得到一株arat缺失菌株（L. casei）1.8727Δarat。通过HPLC方法分析其代谢产物,发现发酵72 h时,PLA产量比出发菌株提高约66.7%,而苯丙氨酸（Phe）比出发菌株提高约57.8%。首次在L. casei 1.8727中成功应用基因编辑手段敲除了arat基因,研究表明该菌株具有自身合成代谢Phe的能力,arat作为PLA代谢途径的关键酶基因,其缺失并未使PLA产量下调,而是促进了PLA与Phe的合成代谢,证明干酪乳杆菌中可能存在其他的代偿途径,arat基因缺失所造成的代谢流的改变最终造成PLA与Phe产量的提高,同时PLA的合成代谢可能涉及多个基因的参与,是一个复杂的代谢网络。研究结果对于深入研究PLA的合成代谢机制具有重要意义,为后续PLA合成代谢途径提供了新的思路及方法。     

1株解淀粉芽胞杆菌的常压室温等离子诱变及其发酵优化

为提高解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM-A2对镰刀菌的抑菌作用,利用常压室温等离子(Atmospheric Room Temperature Plasma, ARTP)诱变技术处理菌株TXM-A2,以禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)为筛选指示菌,获得1株诱变株AR7,其对禾谷镰孢菌的抑制率提升了33.15%。经过5次传代培养,该诱变株的遗传稳定性良好。以诱变株的OD_(600)及无菌滤液对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用为检测指标,采用单因素试验优化发酵培养基,最优配方为葡萄糖10 g/L,酵母浸粉25 g/L,NaCl 5 g/L,优化后OD_(600)由3.250增加至5.543,对尖孢镰刀菌的抑菌直径由2.833 cm增加至3.027 cm。进一步对诱变株进行不同转速条件5 L罐分批发酵,最大活菌数可达1.65×10~9 cfu/mL。利用ARTP技术筛选的诱变株对镰刀菌有较好拮抗作用,扩大培养后活菌数上升,可为生物防治剂开发提供参考。     

保加利亚乳杆菌ATCC11842 L-乳酸脱氢酶同工酶基因的克隆与表达分析

通过对保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）L-乳酸脱氢酶（L-lactate dehydrogenase,L-LDH）同工酶基因的异源表达、酶活测定和摇瓶发酵研究L-LDH在乳酸合成中的作用。将保加利亚乳杆菌ATCC11842中L-乳酸脱氢酶基因ldb0120和ldb0094分别克隆至载体pET28a(+)中,构建重组表达载体pET28aldb0120和pET28aldb0094,并转化到大肠埃希菌（Escherichia coli） BL21(DE3)中进行表达。进一步对重组蛋白进行Ni-NTA柱亲和层析和酶学活性测定,结果显示,LDB0120和LDB0094的比活力分别为0 和25 U/mg,表明LDB0094是具有低活性的L-乳酸脱氢酶,而LDB0120不具有活性。对两株重组菌分别进行好氧和微好氧发酵,重组菌E.coli BL21/pET28aldb0094在好氧和微好氧条件可以合成L-乳酸,浓度分别为41.9和227.9 mg/L,而菌株E.coli BL21/pET28aldb0120在两种培养条件下均基本不合成L-乳酸,推测保加利亚乳杆菌中L-乳酸脱氢酶LDB0094为催化L-乳酸合成的关键酶。首次对保加利亚乳杆菌的L-乳酸脱氢酶同工酶基因进行研究,通过基因异源表达、蛋白纯化、酶活测定和摇瓶发酵,揭示Ldb0094酶为保加利亚乳杆菌ATCC11842中催化L-乳酸合成的关键酶。