uPA基因重组GFP-腺相关病毒载体质粒的构建及其表达

利用基因重组技术,用RT-PCR法从幼鼠肾脏获得uPA cDNA,再克隆到质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建重组质粒pAAV-hrGFP-uPA,通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性,采用磷酸钙共沉淀法,以重组质粒pAAV-hrGFP-uPA和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,产生具有传染性的病毒颗粒;用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度,再将此病毒颗粒体外转染到培养的肾小管细胞中,倒置荧光显微镜观察GFP的表达,用免疫组化法检测转染的uPA蛋白表达,结果表明：成功地构建uPA基因GFP-腺相关病毒重组质粒,病毒滴度达每mL 4×10^13病毒颗粒,60％～70％肾小管细胞感染了病毒颗粒,感染的肾小管细胞能稳定、高效表达外源uPA蛋白,为今后建立AAV-uPA基因治疗肾纤维化的模型奠定了良好的基础．     

大鼠胚胎后肾间充质细胞的分离、培养及鉴定

分离、培养大鼠胚胎后肾间充质细胞(MMCS),取孕13d大鼠胚胎,分离胚胎肾脏,去除输尿管芽,消化后置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养.倒置相差显微镜下观察培养细胞,并行HE染色、电镜观察、生长曲线测定;ABC免疫酶染色法检测波形蛋白、角蛋白、nestin、CD133、CD34;直接免疫荧光法检测双花扁豆凝集素(Dolichos Biflorus,DB),并流式细胞术定量检测.MMCS形态为成纤维细胞样,贴壁生长,48～72h达生长高峰;波形蛋白、nestin、CD133表达阳性;角蛋白、CD34、DB表达阴性;MMCS以DB标记后流式细胞检测为单峰.结果表明:培养细胞为后肾间充质细胞,纯度较高并符合干细胞特征.