定向引入N-糖基化位点改进黑曲霉β-1,4-内切木聚糖酶热稳定性

【背景】木聚糖是生物圈中仅次于纤维素的第二大多糖,其结构复杂,完全降解需要多种木聚糖酶协同作用。β-1,4-内切木聚糖酶是木聚糖主链水解过程中最关键的酶,已广泛应用于饲料、造纸、能源、食品和医药等行业。但在实际应用中,由于真菌木聚糖酶的热稳定性较差,限制了其在工业中的应用。【目的】提高来源于黑曲霉(Aspergillusniger)的β-1,4-内切木聚糖酶(xynB)热稳定性。【方法】采用氨基酸虚拟突变技术对xynB定向引入一个N-糖基化位点,将虚拟突变后筛选获得的候选突变体和野生型在毕赤酵母SMD1168中表达,并对纯化后的野生型和突变体酶进行酶学性质和稳定性分析。【结果】经虚拟突变和筛选获得5个候选突变体,在毕赤酵母SMD1168中成功表达了4个突变体,其中3个突变体发生了糖基化。突变体和野生型酶均表现出宽范围的酸碱耐受性,且突变体xynB~(A92N/D94T)在pH4.0–11.0条件下的稳定性明显优于野生型;糖基化突变体xynB~(A92N/D94T)、xynB~(G66N/A68T)和xynB~(G66F/D67N/G69T)在温度为60–80°C时热稳定性明显高于野生型,xynB~(G66N/A68T)在80°C保温30 min后的残留酶活比野生型提高了约30%。【结论】本研究方法可为其他来源木聚糖酶和其他工业酶的热稳定分子改造提供参考。     

通过毕赤酵母表达系统获得高纯度的重组人血管内皮生长因子 (rhVEGF165)

血管内皮生长因子 (Vascular endothelial growth factor,VEGF165) 是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子,高纯度的VEGF165对于抗肿瘤药物和生物标志物研发检测试剂必不可少。目前关于VEGF165的异源表达方法,纯化步骤多且产物纯度不高。以毕赤酵母表达系统为基础,构建人血管内皮生长因子 (VEGF165) 多拷贝的表达载体。按照酵母密码子偏好性优化人血管内皮生长因子基因 (vegf165) 的密码子,在毕赤酵母BBPB表达载体基础上,用Biobrick生物积块的方法,构建以Pgap为启动子的五拷贝rhVEGF165表达载体,同时添加组氨酸标签。利用His标签和VEGF165自身的肝素结合结构域,仅用两步亲和层析纯化得到纯度高于98%的rhVEGF165蛋白。rhVEGF165纯化后浓度为0.45 mg/mL,且具有生物学活性。该异源表达策略简化了rhVEGF165的纯化步骤,rhVEGF165具有天然VEGF165的生物学活性,且纯度达到目前文献报道的最高水平。