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为探究SQSTM1/p62蛋白在细胞发生自噬时的定位,以人肺腺癌A549细胞的cDNA为模板,PCR扩增SQSTM1基因(编码p62蛋白)并将其插入pEGFP-N1真核表达质粒.将重组质粒转染进入人胚肾293T细胞中表达p62绿色荧光融合蛋白(GFP-p62),利用Earle's盐平衡溶液饥饿诱导细胞自噬,Wester... 相似文献
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调宁蛋白家族进化保守,广泛分布于肌细胞与非肌细胞。目前发现该蛋白家族有碱性、中性和酸性3个异构体,它们在非肌细胞中的功能尚不明确,而酸性调宁蛋白calponin-3是被研究最少的家族成员。本研究通过RT-PCR的方法从人支气管上皮细胞HBE中克隆编码calponin-3蛋白的CNN3基因,克隆至真核表达载体pEGFP-N1。重组质粒pEGFP-N1-CNN3经酶切鉴定和DNA测序正确后,用于瞬时转染细胞。Western blotting检测293T,A549和SMMC-7721细胞内重组绿色荧光融合calponin-3蛋白的瞬时表达,激光共聚焦显微镜分析calponin-3-绿色荧光融合蛋白与罗丹明-鬼笔环肽标记F-actin的细胞定位。结果表明成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-CNN3并在293T、A549和SMMC-7721细胞中高效表达;通过绿色荧光结合免疫荧光染色确定calponin-3与F-actin共定位。成功构建calponin-3蛋白的表达载体,在细胞中瞬时表达并检测其细胞亚定位,为进一步研究calponin-3蛋白的生物学功能奠定基础。 相似文献
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