大白菜包叶特异基因的克隆及其结构特征和表达方式

大白菜营养生长经历幼苗期、莲座期、包心期和结球期4个生育时期,每个时期分别以幼叶、莲座叶、包叶和球叶为主要形态标志.构建了大白菜包心早期茎尖组织特异的cDNA文库,分别与莲座叶和包叶cDNA两个探针进行差异杂交,筛选出一个全长的cDNA克隆BcpLH.DNA序列和推导氨基酸序列同源性比较表明,该基因编码的蛋白质含有两个双链RNA结合结构域(dsRNA-binding domains),与人和小鼠dsRNA结合蛋白基因TRBP具有较高的同源区域.PCR表达分析的结果表明,BcpLH基因主要在包心期的包叶组织中表达.在包心期用IAA涂抹植株显著增加了包叶中BcpLH基因的转录产物.据此认为,BcpLH基因与包叶的发生和叶球的形成有关,它的表达受生长素的诱导调节.     

大白菜BcpLH基因的原核表达及其蛋白产物的Western分析

BcpLH gene preferentially expressed in folding leaf of Chinese cabbage contains dsRNA-binding domains. The cDNA of BcpLH gene was cloned into a His-fusion expression vector pET-28a (+) and was induced to express in E. coli strain BL21 (DE3). Then, the specific protein was partially purified and the rabbit was immunized to prepare the anti-serum. Meanwhile BcpLH cDNA was cloned into the pMAL-c2 containing the solubizing partner, and then the soluble protein generated. It was demonstrated from Western dot assay that the BcpLH protein was specific. The BcpLH active protein and its anti-serum made it possible to study RNA-binding activity and regulation mechanism in plant development.     

水稻双链RNA结合蛋白同源基因OsRBP的克隆及其表达的分析

在基因数据库中发现两个水稻EST片段与大白菜BcpLH基因的双链RNA结合结构域 (dsRBD)有同源的区域 ,根据同源片段的位置特征设计引物 ,用RT-RCR扩增粳稻 (Oryzasativasubsp .japonica)愈伤组织的cDNA ,得到大小为 1.8kb的DNA片段。该cDNA片段含完整的编码区 ,有两个典型的dsRBD ,分别与BcpLH的dsRBD在氨基酸水平上同源性为 75 %左右 ,故将其命名为OsRBP。RT -PCR表达分析显示该基因在未成熟的种子和愈伤组织中表达 ,在根、茎、叶、穗、成熟种子及胚芽鞘中没有表达信号 ,由此推测该基因的表达可能与种子和胚的早期发育相关。该研究首次从水稻中分离到双链RNA结合蛋白基因 ,并初步研究了其表达方式 ,为进一步探讨水稻重要器官的发育和植物中双链RNA结合蛋白的调节作用奠定了基础     

绿色荧光蛋白基因结合鼠Talin基因蛋白标记转基因水稻未成熟花粉的微丝骨架

利用绿色荧光蛋白基因结合鼠Talin基因表达技术及水稻转基因技术,在未成熟花粉发育期(即生殖细胞在形成后从靠壁部位移向中央部位的阶段)的水稻(Oryza sativa L.)内发现了一系列前人未曾报道过的微丝骨架的形成和多变过程.在这一发育阶段,未成熟花粉内的生殖细胞呈圆形,中央部位存有一个大液泡,大量微丝在细胞的中央胞质内形成.微丝首先在营养核的核膜表面形成两个集结中心,中心内的微丝呈短粗状.尔后,中心微丝不断延长,最终在细胞中央的胞质内形成一个非常复杂的类似多个纺锤体结合在一起的网络结构.这一网络的中间部位经常包围着营养核和生殖细胞,网络的部分微丝则与存在周缘细胞质(或称周质)的微丝网络形成连接,在连接点部位则形成一些由微丝环状组成的结构.未成熟花粉中央的微丝网络可能与营养核和生殖细胞在未成熟花粉内的运动有密切关系.     

大白菜BcPLH基因的原核表达及其蛋白产物的Western分析

BcpLH基因是大白菜包叶组织特异的新基因,含有双链RNA结合域。在含有His标记序列的原核表达载体pET28-a(+)上插入Bc-pLH基因的cDNA,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出了特异性蛋白,并免疫大白兔制备出高效价的抗血清;同时,将BcpLH基因插入到含有超级助溶剂的pMAL-c2载体上,并在大肠杆菌DH5α中诱导表达,结果获得了可溶的蛋白。Western斑点印迹分析的结果证明了BcpLH的特异性。BcpLH活性蛋白及其抗血清的产生为研究BcpLH基因的RNA结合