三重PCR检测鱼类致病性嗜水气单胞菌

[目的]建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的PCR.方法.[方法]根据嗜水气单胞菌的16S rRNA、气溶素基因(aer)和丝氨酸蛋白酶基因(ahp)的保守序列设计了3对引物,然后进行了PCR反应条件的优化、特异性和敏感性的检测并与普通的细菌分离鉴定进行了临床样本和人工攻毒样本检出率的比较.[结果]该方法特异性好,只对致病性嗜水气单胞菌呈阳性扩增;敏感性高,最低可检测100fg的细菌DNA模版.对临床疑似黄鳝(Monopterus albus)样本的检出率为81.8%,高于细菌分离的40.9%;对人工攻毒鲫鱼(Carassius auratus)样本的检出率为87.5%,高于细菌分离的67.5%.[结论]本方法的成功建立,实现在同一反应管中同时对16SrRNA、aer和ahp的检测,避免了只针对aer或ahp单个毒力基因的PCR检测方法可能存在的漏检和误检,为致病性嗜水气单胞菌的诊断、大规模检疫、流行病学调查等提供了一种快速、准确而有效的检测方法.     

腺病毒载体介导的GFP基因在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干扰

目的：建立在鸭胚成纤维细胞（DEF）中进行RNA干扰（RNAi）的技术平台,为鸭基因组功能的研究提供新的技术手段。方法：以绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因,脂质体转染化学合成的GFP特异小干扰RNA（GFP-siRNA）,用流式细胞仪测定GFP-siRNA对重组腺病毒（Adv-GFP）介导的GFP基因在DEF中表达的干扰效果。结果：200MOI（感染复数）Adv-GFP介导的GFP基因在DEF中表达效率最高,为31．20％±3．1l％,对DEF的活力无明显影响;GFP-siRNA能有效干扰GFP基因在DEF中的表达,相对抑制率为98．56％。结论：在DEF中进行RNAi是可行的,Adv-GFP是介导外源基因在DEF中表达较为理想的载体;首次建立了在DEF中进行RNAi的技术平台,为鸭基因组的功能等研究提供了新的技术手段。     

布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体双重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同步检测布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体的双重PCR方法,根据GenBank上公布的布鲁氏菌Bp26基因和贝纳氏柯克斯氏体IS1111a基因,利用Primer premier 5.0软件各设计一对特异性引物,分别扩增出219 bp和130 bp的目的片段,通过优化PCR反应体系和扩增条件,建立起了能够同步快速检测布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体的双重PCR方法,该方法具有较好的特异性、可重复性和较高的灵敏性。利用该双重PCR方法对流产牛抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液等172份临床样品进行检测,共检测到布鲁氏菌感染阳性样品53份,贝纳氏柯克斯氏体感染阳性样品10份,混合感染阳性样品2份,阳性检出率分别为30.8%、5.8%、1.2%。初步临床应用结果表明,该方法可用来安全、同步、快速、灵敏地对布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体进行检测。