通粳1号水稻乙醛脱氢酶基因的克隆及原核表达

目的：克隆通粳1号水稻乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase,ALDH）基因,并在大肠杆菌中进行体外表达。方法：提取通粳1号水稻幼根总RNA,RT-PCR法扩增ALDH基因开放阅读框架片段,双酶切后连接至pET5a表达质粒中,转化BL21（DE3）宿主菌,平板培养筛选,挑取阳性菌落并提取质粒,酶切、电泳鉴定插入片段并测定其序列。含重组质粒的BL21（DE3）进行常规LB扩大培养,用不同浓度的IPTG作用不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。结果：质粒中插入的ALDH片段为1668bp,含有完整的开放阅读框架,序列与GenBank比较无差异,插入方向正确无误,表达蛋白分子量为61.8kDa左右,符合预期值,IPTG最佳诱导时间为3h,0.1mmol/L～0.8mmol/L浓度的IPTG作用效果无显著差异。结论：该基因的成功克隆和表达为进一步研究水稻中ALDH的作用和应用生物工程法大量获得ALDH奠定基础。     

通育粳1号水稻乙醇脱氢酶基因克隆与原核表达

克隆通育粳1号水稻乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,并在原核系统中进行体外表达。取通育粳1号水稻幼根,提取总RNA,RT-PCR法扩增ADH基因开放阅读框架片段,双酶切后连接至pGEX-4T-1表达质粒中。将质粒转化至BL21(DE3)宿主菌中,平皿培养,挑取阳性菌落培养,提取重组质粒,酶切、电泳鉴定插入片段并测定其序列。pGEX-4T-1-ADH/BL21进行常规LB扩大培养,IPTG(1 mmol/L)作用2、3和4 h诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。结果显示,插入质粒中的ADH片段序列和方向正确无误,表达蛋白分子量符合预期值42 kD,表达至最大值的诱导时间为3 h。因此,该基因的成功克隆和表达为进一步研究水稻中ADH的作用和应用生物工程法大量获得ADH奠定基础。