人骨髓造血干细胞体外培养中的动态变化

本文报告100多批人的骨髓细胞长期体外培养的实验结果。在首次接种骨髓细胞建立起贴壁层细胞基础上,再将另一个体的骨髓细胞接种在贴壁细胞层上面,这样就可使骨髓中的造血干细胞在贴壁细胞层上增殖和分化,维持较长时间。人类多向性造血干纽胞(CFU-S)目前尚无测定的方法,但由CFU-S分化出来的粒系祖细胞(CFU-C)和红系祖细胞(CFU-E)是有方法可以测定的,从此获得的结果表明,在体外培养条件下,CFU-C可存活9周,CFU-E可存活4.5周。在培养悬液细胞中,形态上可以识别的主要有粒细胞,其存在时间与CFU-C大致相同,而红系细胞仅在3周内可以见到,成熟淋巴细胞最多能存活5周,以后就不复存在了。在培养7周内,每个培养瓶中平均悬液细胞数是增加的。从干细胞自杀实验证明,CFU-C至少在6周内不断地有一部分细胞进入DNA合成期。在整个培养期间,各系统的造血祖细胞及其后代细胞,它们的存活时间虽有差别,但均保持着正常的生物活性。7周以后,培养体系中的细胞总数就逐渐减少,到了9周后因为造血干细胞业已消失,所以各种成熟的或未成熟的血细胞也就逐渐不见了。在骨髓细胞培养液中还存在着CSF,其浓度随着CFU-C总数的下降而平行地降低,提示在体外培养体系中可能存在对造血干细胞活动的调节因子。此外,也观察了培养瓶中悬液细胞与贴壁细胞间的相互关系及其某些造血特征。     

人骨髓体外培养中贴壁细胞层的形态分析

骨髓细胞体外培养是为体外造血研究建立一个模型。根据近年来国外学者研究小鼠骨髓细胞培养,和我们自己对人骨髓细胞培养的经验,认为初步建立起贴壁细胞层是很重要的。因为体内造血器官中由间质组成的造血微环境,是造血干细胞生存和活动的基地。在体外培养研究中,贴壁细胞层的形成能在一定程度上起到体内造血微环境的作用。贴壁细胞层的主要成分是由成纤维细胞、巨噬细胞、上皮样细胞、脂肪细胞以及未分化细胞和少数分类不明的细胞组成。从数量上看,成纤维细胞和巨噬细胞占多数;在组织结构上是以成纤维细胞为支架,把各种细胞连接融合在一起,形成重叠的细胞层。依赖这种贴壁细胞层作为体外造血的“微环境”,可使造血干细胞存活较长时间,尤其对粒系统的增殖和分化更为适宜。贴壁细胞层除了在结构上有利于造血干细胞的生存外,其中巨噬细胞可能产生某些活性物质,调节造血干细胞的活动。     

体外培养的胎肝细胞半同系移植效果的研究

以Dexter体系成功地建立了小鼠胎肝细胞体外长期培养技术。培养的胎肝造血干细胞(CFU-S)有旺盛的增殖力。半同系移植研究证实,5×10~6个培养细胞(含780～1200CFU-S)可使9.5Gy γ-线照射的受体小鼠30d和60d存活率达80％和74％。1个月造血功能恢复。无移植物抗宿主病(GVHD)征象,并在受体内形成了稳定的嵌合体。说明体外培养的胎肝细胞能有效地重建造血。观察小鼠移植后14.5个月的远期疗效,其造血机能健全,体内CFU-S的移植效力与正常相似。然而CFU-S的再生速率和自我更新力均较正常同龄鼠低,揭示出长期增殖状态的造血干细胞功能上的变化。     

在不稳定和相对稳定培养体系中CFU-S生长的动力学观察

利用 Dexter 培养方法,我们在体外对小鼠胎肝进行了长期液体培养。根据换液后悬液细胞总数的不同,建立了不稳定和相对稳定两个培养体系,并利用12d 脾结节检测和单个脾结节转移技术,观察了体系中悬液细胞总数,CFU-S 数及其自我更新的动态变化。表明在不稳定培养体系中,悬液细胞总数和 CFU-S 数增长较快,但由于每周换液时悬液细胞的丢失,可能使体系长时间处于应激状态,其自我更新力衰减也较快。而在相对稳定体系中,由于换液时其悬液细胞的再次种入,使总数保持相对恒定,CFU-S 数的变化比较平缓,其自我更新力的衰减也相对缓慢。提示在造血细胞体外液体培养体系中存在着一种生理性反馈调节活动,但其机理有待进一步研究。     

人骨髓细胞培养液中干细胞刺激物的分析研究

人骨髓细胞体外培养液中含有高活力的 CSF,在长期培养过程中,CSF 活力的变化,与 CFU-C 数量的变化有大致平行的趋势。这种 CSF 对狗和小鼠也同样有效。人骨體条件液中的 CSF 对培养中的 CFU-S 也有明显的激发作用。这一结论可以从几个方面获得证据:第一,小鼠骨髓细胞与人骨髓条件液保温六小时后,再测定其中 CFU-S 数,结果是增加了。第二,经亚致死剂量照射的小鼠,腹腔注射适量的人骨髓条件液,其内源性脾结节也明显增多。第三,采用阿糖胞苷自杀的方法,测定小鼠骨髓经与人骨髓条件液保温后,其中 CFU-S 的自杀率也有增高的趋势。上述几方面的实验,说明人骨髓长期培养中存在着某种活性物质,调节体外造血。至于这种物质的来源,以及在体外造血中所起的作用,还需要做很多工作,逐步予以澄清。     

狗骨髓长期培养的贴壁层细胞及条件培养液对粒系祖细胞的影响

本文报告狗骨髓长期培养的初步研究结果。采用马血清与狗血清混合加入培养体系中,可建立起比较稳定的贴壁细胞层,可以维持19周以上。但是,这种贴壁层不能有效地维持造血干细胞的增殖与分化,上清液中血细胞与GM-CFU_C的数目,在第二次接种骨髓后2—3周即迅速下降。狗骨髓培养的条件液中存在着抑制GM-CFU_C生长的物质,但它对小鼠骨髓GM-CFU_C和CFU-S无影响。如以贴壁细胞作为底层,用双层琼脂平皿培养法与正常狗骨髓共同培养,发现贴壁细胞不仅没有抑制反而有加强CSF刺激GM-CFU_C生长的作用。因此对狗骨髓长期培养体系不能长期支持造血干细胞生长和繁殖的可能原因尚须作进一步探索。     

人骨髓细胞在扩散盒血浆凝块培养中增殖和分化的特点

人骨髓细胞在体内扩散盒血浆凝块培养条件下可生成以红系细胞团(CFU-E,BFU-E)为主,伴有其它各种类型细胞团(CFU-MIX,CFU-C,CFU-m,CFU-Eo)分化的模式。培养8—10天后,CFU-E 和 CFU-C 的生成数量分别与种入的骨髓有核细胞数呈正比关系;培养8—16天期间,出现粒系与红系混合型细胞团,这种混合型细胞团可能起源于多向性造血千细胞。在多次培养中也出现嗜酸细胞团,但产生这种细胞团的机遇并不恒定。对于扩散盒血浆凝块培养系统产生多样细胞团及其意义,进行了全面分析与讨论。     

外周血造血干细胞移植的实验观察

外周血白细胞中存在着少量的造血干细胞。对某些造血功能损伤的动物或人,移植外周血造血干细胞可以促进机体造血功能的恢复。但是,在外周血中存在着大量的免疫活性细胞,因此,在同种异体移植中,由于个体组织抗原的差异,输入大量免疫活性细胞