鸡胚睾丸支持细胞的分离、纯化与鉴定

以18天鸡胚睾丸为实验材料,经胶原酶和胰蛋白酶两步酶消化法得到生精上皮细胞悬液.在原代培养过程中经差异贴壁和低渗处理后,获得了纯度约为90%的单层支持细胞.对纯化的培养物染色鉴定,结果显示支持细胞为碱性磷酸酶(AKP)阴性,而混杂在其中的另一种体细胞管周细胞为AKP阳性;油红O染色显示,支持细胞胞质内含有大量的脂肪滴,核内见双极小体;吖啶橙染色证实支持细胞富含RNA;罗丹明123染色显示支持细胞富含线粒体;Hoechst 33342染色显示支持细胞细胞核呈长卵圆形,核的长轴与细胞长轴平行;免疫荧光染色显示支持细胞胞质中表达波形蛋白.建立了一套简单、易行的鸡胚睾丸支持细胞分离纯化与鉴定方法.     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.