PCR在HBV核酸定量检测中的应用

目的:探索一种简便定量分析系统,通过检测HBV携带者血清中的HBV X区DNA,fRNA和trRNA拷贝数,为提高隐匿性感染期低复制状态HBV检测效果提供可能。方法:从血清中提取HBV DNA和RNA,对Core区、X区DNA进行PCR扩增,使用半巢式PCR法对fRNA、trRNA在同一离心管中进行反转录并扩增,选取大小相近的质粒作为竞争模板对其进行定量。并对拉米夫定干预治疗14周前后的患者血清中HBV XDNA、Core DNA、fRNA和trRNA拷贝数进行检测与比较。所有检测结果均通过southern杂交进行验证。结果:建立了针对DNA的定量分析系统及针对RNA的RT-PCR定量分析系统,并且阐明了阿米夫定治疗前后HBV DNA和X区RNA结构和数量的变化。治疗前治疗后DNA和RNA的拷贝数均下降。Core DNA下降显著,为103-104倍,而XDNA拷贝数下降102倍。而fRNA和trRNA仅有小幅下降,为10倍左右。结论:可以通过竞争性PCR方法对血清中HBV DNA和RNA进行定量检测,以期为HBV病毒的诊断提供更充足依据。     

实时定量RT-PCR对乙型肝炎病毒全长RNA(fRNA)的定量检测

目的:建立一种简便的定量检测慢性乙型肝炎患者血清中终止于聚腺苷酸化位点的乙型肝炎病毒全长RNA(f RNA)的方法。方法:选取53例未治疗的乙型肝炎患者及22例HBs Ag阴性的健康者为研究对象,使用锚定oligo-d T的引物对其血清中f RNA进行实时定量反转录PCR检测,统计分析其与HBV DNA、HBcr Ag和HBe Ag的相关性。结果:对f RNA进行实时荧光定量RT-PCR检测的下线为2.3 log copies/ml,标准曲线的相关系数为0.99(P0.0001)。53例乙型肝炎患者中,29例(54.7%)可以检测到f RNA,22例正常对照中没有检测到f RNA。27例HBe Ag阳性和/或高水平HBV DNA的患者全部检测到f RNA,26例HBe Ag阴性并且低水平HBV DNA的乙型肝炎患者中有2例(7.7%)检测到f RNA(P0.0001)。HBe Ag阳性患者血清中f RNA水平高于HBe Ag阴性患者(5.0±0.3 vs.2.9±0.4 log copies/ml,P0.001)。f RNA与HBV DNA/HBcr Ag具有显著相关性(r=0.905、0.881,P0.0001)。Hayashi's定量分析法I显示f RNA与HBV DNA相关性强于其与HBcr Ag的相关性。结论:与HBV DNA和HBe Ag一样,f RNA可作为常规检测判断HBV的复制水平并指导用药。